非小细胞肺癌细胞中上皮特异性黏附分子的表达及其对细胞增殖和侵袭能力的影响

刘春华，王俊轶，银 春，张 艳，姜 琪

1)四川绵阳四〇四医院呼吸内科 四川绵阳 621000 2)成都市第三人民医院呼吸与危重症医学科 成都 610031

肺癌是常见的肺部恶性肿瘤，根据组织病理学特性将其分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC占80%～85%。近年来，肺癌在全球范围内的发病率一直呈上升趋势，严重威胁人类的健康[1-2]。上皮特异性黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)属于黏附分子家族的单次跨膜糖蛋白，在大肠癌、前列腺癌和胃癌等多种人类肿瘤组织中异常表达，通过调控相关信号通路或靶基因参与肿瘤细胞的增殖、分化、黏附、侵袭和迁移等过程，与肿瘤的发生发展关系密切[3-5]。有研究[6-7]指出，高表达EpCAM与肺癌转移和预后不良关系密切，其可能在肺癌的发生发展中发挥重要作用。目前，EpCAM在NSCLC中的作用尚不清楚，本研究通过观察EpCAM在3种NSCLC细胞株H226、A549和PC-9中的表达，并构建EpCAM低表达的A549细胞，从细胞水平上探讨EpCAM对NSCLC细胞增殖及侵袭的影响，以期为NSCLC的治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1材料正常支气管上皮BEAS-2B细胞、肺鳞癌H226细胞、肺腺癌A549细胞、肺腺癌PC-9细胞均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。胎牛血清、DMEM培养基和胰蛋白酶购于美国Gibco公司，反转录试剂盒购于日本TaKaRa公司，青/链霉素、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒和CCK-8细胞活力检测试剂盒购于上海碧云天公司，脱脂奶粉购于北京中杉金桥生物技术有限公司， ECL超敏发光液购于北京普利莱基因技术有限公司。EpCAM抗体、β-actin抗体、Ki-67抗体、MMP-9抗体和HRP-羊抗兔/鼠IgG购自美国Santa Cruz公司。EpCAM shRNA慢病毒颗粒和对照shRNA慢病毒颗粒购于美国Santa Cruz公司。qRT-PCR试剂盒购于美国MBI Fermentas公司，PCR引物购于上海吉玛生物公司。Transwell小室、PVDF膜购于美国Millpore公司，Matrigel胶购于美国BD公司。Multiskan FC酶标仪购于美国Thermo Scientific公司，转印电泳仪、多功能凝胶成像系统购于美国Bio-Rad公司，分光光度计购于北京凯奥公司。

1.2细胞培养采用含有体积分数10%胎牛血清、100 g/L链霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培养基接种BEAS-2B细胞和NSCLC细胞H226、A549、PC-9，置于体积分数5%CO2、37 ℃恒温的细胞培养箱常规培养。经换液(每3 d一次)和传代(每周2次)后，收集对数生长期的细胞进行实验。

1.3BEAS-2B、H226、A549和PC-9细胞EpCAMmRNA表达的检测采用qRT-PCR法进行检测。取收集到的对数生长期BEAS-2B、H226、A549和PC-9细胞，加入Trizol试剂提取总蛋白，分光光度计对所提总蛋白进行浓度和纯度的检测。EpCAM上游引物5’-TGCTCTGAGCGAGTGAGAA-3’，下游引物5’-TGCAGTCCGCAAACTTTTA-3’； 内参β-actin上游引物5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游引物5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。采用反转录试剂盒合成cDNA。取2 μL cDNA，加入10 μL Mix、各1 μL上下游引物和6 μL ddH2O 配制反应体系。经离心将20 μL反应体系混匀后，放入PCR仪中，设置PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(40个循环)；72 ℃ 8 min。采用2-ΔΔCt法计算EpCAM mRNA相对表达量。实验重复3次。

1.4BEAS-2B、H226、A549和PC-9细胞EpCAM蛋白表达的检测采用Western blot法进行检测。收集对数生长期的BEAS-2B、H226、A549和PC-9细胞，分别根据总蛋白提取试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒提取和检测总蛋白。取总蛋白50 g，加入4×蛋白上样缓冲液混合后于沸水浴中5 min变性，行120 g/L SDS-PAGE凝胶电泳。上样后先以90 V电泳30 min，改换120 V电泳90 min结束分离总蛋白，再以30 V电压转膜90 min。将含有蛋白的PVDF膜浸泡于50 g/L脱脂奶粉封闭液2 h。加入EpCAM抗体(1∶200)和β-actin抗体(1∶1 000)，于4 ℃条件下反应24 h。经TBST漂洗后，加入HRP-羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶6 000)，常温反应1 h。以ECL显影，凝胶成像系统拍照，采用Image J软件分析EpCAM 蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.5A549细胞转染效果评价取24孔细胞板，以每孔3.5×105个细胞接种，将A549细胞分为对照组、阴性对照组和EpCAM干扰组。于培养箱中培养24 h，待细胞融合度达80%左右时，进行慢病毒感染。分别向EpCAM干扰组和阴性对照组培养液中加入EpCAM shRNA和对照shRNA慢病毒悬液，对照组中加入等体积培养液。充分混匀后，孵育24 h。以1 mL完全培养液替换原培养液后，孵育24 h。继续培养48 h后，以2 mg/L嘌呤霉素重悬细胞，以适当浓度种植于96孔板上，每3 d更换培养液(含嘌呤霉素)，确认克隆形成后，筛选几个克隆，参照1.3和1.4中的方法检测各组细胞中EpCAM mRNA和蛋白的表达情况，以评价其转染效果。

1.6A549细胞增殖能力检测采用CCK-8法进行检测。收集对数生长期的A549细胞，以每孔200 μL(细胞密度为3×104个/mL)种植到96孔板上。于培养箱内常规培养24 h后，按照1.5中方法进行转染。每组各设5个平行孔，实验重复3次。按照实验要求培养24、48和72 h后，加入CCK-8溶液20 μL，反应2.5 h后，采用酶标仪检测各组细胞在570 nm处的光密度(OD)值。

1.7A549细胞克隆形成能力检测采用细胞平板克隆实验进行检测。取对数生长期的A549细胞，按照1.5中的分组处理细胞后，以胰蛋白酶消化制备密度为3×104个/mL的细胞悬液，以每皿5 mL接种至培养皿上，培养箱内常规条件培养10 d(形成肉眼可见细胞集落)。弃上清后，以磷酸缓冲液洗涤细胞。采用体积分数为10%甲醇固定，质量分数为0.1%结晶紫染色，各30 min。冲洗染色液后，晾干。在显微镜低倍镜下选取5个视野，观察并计数。实验重复3次。

1.8A549细胞侵袭能力检测采用Transwell小室进行检测。将对照组、阴性对照组和EpCAM 干扰组A549细胞以无血清培养基配制成密度为3×104个/mL的细胞悬液。取Transwell小室，以50 μL Matrigel溶液包被聚碳酸酯微孔膜，常温下聚合30 min。下室中每孔加入100 μL含血清的完全培养基，收集各组细胞，按照每室100 μL加入上室，于细胞培养箱内常规培养30 h。以棉签小心擦去基质胶和上室内的细胞，常温下甲醛固定，结晶紫染色，各15 min。显微镜下选取5个200倍视野，统计穿过滤膜的细胞数。实验重复3次，结果取平均值。

1.9A549细胞中Ki-67和MMP-9蛋白表达的检测采用Western blot法进行检测。收集对照组、阴性对照组和EpCAM干扰组A549细胞，经提取总蛋白、电泳、转膜和封闭后，加入特异性一抗Ki-67抗体(1∶800)、MMP-9抗体(1∶500)和β-actin抗体(1∶1 000)，反应过夜后，再加入二抗。显影曝光后，凝胶成像系统拍照，采用Image J软件进行分析。实验重复3次。

1.10统计学处理采用SPSS 22.0进行统计学处理。BEAS-2B细胞及3种NSCLC细胞间EpCAM蛋白和mRNA相对表达量的比较，对照组、阴性对照组和EpCAM干扰组间EpCAM mRNA、EpCAM蛋白、Ki-67蛋白、MMP-9蛋白相对表达量以及OD值、细胞克隆数、侵袭细胞数的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1EpCAM在BEAS-2B细胞及3种NSCLC细胞中的表达及其在A549细胞中的干扰效果结果见图1和表1。与正常支气管上皮BEAS-2B细胞相比，A549、H226和PC-9细胞中EpCAM蛋白和mRNA表达均升高，并且3种NSCLC细胞中EpCAM蛋白和mRNA的表达水平依次为A549>PC-9>H226。因此，选用A549细胞开展后期实验。对照组、阴性对照组和EpCAM干扰组中EpCAM mRNA的相对表达量分别为(1.00±0.12)、(1.02±0.08)和(0.21±0.02)(F=90.609，P<0.001)；EpCAM 蛋白的相对表达量分别为(0.62±0.07)、(0.54±0.05)和(0.10±0.01)(F=94.080，P<0.001)。与对照组相比，阴性对照组中EpCAM mRNA和蛋白的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，但EpCAM干扰组中EpCAM mRNA和蛋白的相对表达量均降低(P<0.05)。

图1 EpCAM在BEAS-2B细胞、3种NSCLC细胞中的表达(A)及其在A549细胞中的干扰效果(B)

*：与BEAS-2B细胞相比，P<0.05；#：与H266细胞相比，P<0.05；△：与PC-9细胞相比，P<0.05

2.2干扰EpCAM表达对A549细胞增殖的影响结果见表2。与对照组相比，阴性对照组A549细胞OD值差异无统计学意义；EpCAM干扰组A549细胞OD值与对照组相比均降低。

表2 各组A549细胞OD值比较(n=3)

*：与其他2组相比，P<0.05

2.3干扰EpCAM表达对A549细胞克隆形成和侵袭能力的影响结果见表3。与对照组相比，阴性对照组中细胞克隆数和侵袭细胞数差异无统计学意义，干扰EpCAM表达能够减少细胞克隆数和侵袭细胞数。

表3 各组A549细胞克隆数和侵袭细胞数的比较(n=3)

*：与其他2组相比，P<0.05

2.4干扰EpCAM表达对A549细胞中Ki-67和MMP-9蛋白表达的影响结果见图2和表4。阴性对照组Ki-67和MMP-9蛋白的表达水平与对照组比较，差异无统计学意义；而EpCAM干扰组两种蛋白的表达水平均降低。

图2 各组A549细胞中Ki-67和MMP-9蛋白表达的检测结果

组别Ki-67MMP-9对照组0.78±0.050.59±0.03阴性对照组0.82±0.040.62±0.05EpCAM干扰组0.34±0.02*0.38±0.02*F141.86740.500P<0.001<0.001

*：与其他2组相比，P<0.05

3 讨论

EpCAM基因广泛存在于人上皮组织中，其蛋白是由肿瘤相关钙信号转导1基因编码的相对分子质量为40 000的单次跨膜蛋白，它由单次跨膜区、胞外结构域和胞内激酶结构域组成，其中胞内部分氨基酸可将信号传递到胞核，发挥调控下游基因的作用，进而参与细胞间黏附、增殖、分化和转移等生物学行为。大量研究[8-10]指出，EpCAM在上皮性卵巢癌和乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤的临床分期、淋巴结转移和肿瘤分化程度等关系密切。在结肠癌中，利用siRNA沉默EpCAM基因，可明显降低细胞或干细胞的增殖和侵袭能力，同时增强其对伊立替康、卡培他滨药物的敏感性[11-12]。同时，在体内上皮癌小鼠模型和体外培养的视网膜母细胞瘤细胞中下调EpCAM的表达，能够减弱细胞增殖[13]。有研究[7]指出，高表达EpCAM与肺癌转移和预后不良有关，但其在NSCLC中的作用尚不清楚。本研究采用qRT-PCR和Western blot观察EpCAM在H226、A549和PC-9细胞株中的表达。结果发现，与正常支气管上皮BEAS-2B细胞相比，3种NSCLC细胞中EpCAM蛋白和mRNA表达水平均明显升高，且腺癌细胞中的表达水平高于鳞癌细胞。提示，EpCAM在NSCLC的发生发展中发挥着重要作用。成功干扰A549细胞中EpCAM的表达后，采用CCK-8和平板克隆实验进行检测后发现，细胞的增殖、克隆形成能力均明显减弱；同时，采用Transwell小室检测细胞的侵袭能力，结果也发现细胞的侵袭能力受到抑制。可见，干扰EpCAM的表达可抑制A549细胞的增殖和侵袭，这与Zhou等[8]的研究结果相吻合。

肿瘤细胞的无限增殖和侵袭转移是恶性肿瘤发生发展的重要机制。Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，可作为检测肿瘤细胞增殖能力的可靠指标；肿瘤侵袭和转移的关键环节是基底膜和细胞外基质的降解，而在降解细胞外基质过程中发挥重要作用的唯一酶类是MMP；MMP-9可通过降解Ⅳ型胶原破坏肿瘤细胞侵袭、转移的组织学屏障，从而引发恶性肿瘤的侵袭和转移。Ki-67和MMP-9表达与NSCLC患者病理类型、肿瘤分化程度和淋巴结转移等有着密切关系[14-15]。在胃癌细胞中，EpCAM与Ki-67表达呈正相关，EpCAM表达水平越高，胃癌细胞增殖能力越强[16]；乳腺癌细胞中，敲除EpCAM基因可通过抑制Ras/Raf/ERK信号通路和MMP-9表达抑制癌细胞的增殖和侵袭[17]。为了探讨干扰EpCAM表达抑制A549细胞增殖和侵袭的分子机制，本研究采用Western blot检测抑制EpCAM表达后A549细胞中Ki-67和MMP-9蛋白的表达情况，结果显示两种蛋白的表达水平较对照组均明显降低。提示，干扰EpCAM的表达可能通过降低Ki-67和MMP-9的表达抑制A549细胞的增殖和侵袭。

总之，本研究发现EpCAM在NSCLC细胞中高表达，且腺癌中的表达水平高于鳞癌，提示EpCAM在NSCLC的发生发展中发挥着重要作用。干扰EpCAM的表达可抑制A549细胞的增殖和侵袭，其分子机制可能与抑制Ki-67和MMP-9的表达有关。这一结果为NSCLC的诊断和治疗提供了新的线索和依据。