不同焦油释放量卷烟诱导TK基因突变能力的比较研究

尚平平，华辰凤，谢复炜，李 翔*

（中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南 郑州450001）

卷烟烟气是含有6 000多种化学成分的复杂气溶胶，其中有69种表现出遗传毒性[1]，目前，卷烟烟气的危害评价主要以体外毒性试验为主。体外毒性试验具有周期短，灵敏度高等特点，是反映卷烟风险的有力手段，在卷烟烟气的危害评价中具有重要作用[2]。在进行卷烟烟气危害评价时，国内外多采用Ames试验和体外微核试验来评价其遗传毒性[3]。近年来，TK基因突变试验因具有检测谱较广、检出灵敏度较高、简便易行等特点，得到了较快发展和不断完善。欧盟、美国和中国在进行食品添加剂、食品接触材料用物质、药品、化妆品等安全性毒理学评价时，也将其作为必选或备选的遗传毒性试验方法之一。

吸烟与健康一直是国内外关注的热点，随着世界卫生组织（World Health Organization，WHO）发布的《烟草控制框架公约》逐渐实施生效，中国烟草在卷烟降焦减害方面开展了大量研究工作[4]，从烟叶原料、卷烟配方、辅助材料和加工工艺等方面降低卷烟烟气的危害，研制了低焦油卷烟、动植物提取物添加卷烟[5]、减害功能材料添加卷烟等[6]。而如何比较不同卷烟的遗传毒性强度的差异，国内外均进行了探索性研究[7-9]。

我们将不同焦油释放量的卷烟，采用标准抽吸条件下收集的卷烟烟气冷凝物（cigarette smoke condensate，CSC）对L5178Y tk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞进行染毒，计算各卷烟样品的三氟胸苷抗突变频率（trifluorothymidine resistance mutation frequency，TMF），利用SPSS 17.0对数据进行线性拟合，初步比较不同卷烟样品的TK基因致突变能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试物及主要试剂 盒标焦油分别为5、8和11 mg的1、2和3号市售卷烟，马血清（批号1856573）和RPMI 1640培养基（批号1924300）均购自Gibco公司，胸腺嘧啶核苷（批号WXBC1817V）、氨甲碟呤（SLBK2839V）、次黄嘌呤（批号 SLBD4750V）、甘氨酸（批号 BCBM6203V）、三氟胸苷（批号 BCBL1812V）、环磷酰胺（批号068K1131）均购自Sigma公司，SD大鼠肝S9购自武汉普莱特生物医药技术有限公司（批号S10013）；二甲基亚砜购自上海翊圣生物有限公司（批号D0306）。

1.1.2 细胞株 L5178Y tk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞，由解放军疾病预防控制所毒理学评价研究中心赠送。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 L5178Y tk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞在37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度条件下常规悬浮培养，细胞浓度为1×106/mL，采用含10%马血清和适量抗菌素的RPMI 1640培养基，在96孔板上表达培养时采用含20%马血清的RPMI 1640培养基。

1.2.2 自发突变清除 为避免细胞的自发突变对实验结果产生影响，在正式实验前，进行自发突变清除工作。用含3 g/mL胸腺嘧啶核苷、5 g/mL次黄嘌呤、0.1 g/mL氨甲碟呤和7.5 g/mL甘氨酸的THMG培养基处理细胞24 h，800 r/min离心5 min，洗涤后在不含氨甲碟呤的THG培养基中培养2 d。

1.2.3 受试物处理 卷烟样品在（22±2）℃、相对湿度（60±3）%的环境下平衡48 h后，并在此环境下采用ISO 4387抽吸方法（抽吸容量35 mL，每次抽吸2 s，每60 s抽吸一次）于转盘吸烟机抽吸3个卷烟样品各20支，抽吸结束后，用DMSO以10 mg/mL萃取滤片上的CSC，-80℃保存待用。

1.2.4 染毒 根据细胞毒性的相对存活率确定的试验剂量分别为20、40、80、100、150μg/mL，取生长良好的L5178Y细胞，调整细胞浓度为5×105/mL，按1%体积加入受试物CSC。阳性对照组加入环磷酰胺，阴性对照组加入DMSO。37℃振摇处理3 h。800 r/min离心5 min后，弃上清液，用不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重悬细胞于含10%马血清的培养基中。

1.2.5 第0天平板接种效率的测定 按每毫升8个细胞，接种96孔板（每孔加0.2 mL，即平均每孔1.6个细胞），每个剂量作2块板，37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度条件下培养12 d，计数每块平板有集落生长的孔数，计算第0天平板接种效率（PE0）。

式中EW为无集落生长的孔数，TW为总孔数，1.6为每孔接种细胞数。

1.2.6 表达培养2 d平板接种效率的测定 将细胞悬液调整细胞浓度为2×105/mL，48 h表达培养（每天计数细胞浓度并保持浓度在1×106/mL以下）后，计算相对悬浮生长（RSG）和相对总生长（RTG）。

式中RS2为第2天的相对存活率。

然后按照PE0的方法接种96孔板，培养12 d后，计算PE2，方法同PE0。

1.2.7 TFT抗性突变频率测定 48 h表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞浓度为1×104/mL，加入终浓度为3 g/mL的三氟胸苷，混匀，接种96孔板（每孔加0.2 mL），每个剂量作2块板培养12 d后，计数有突变集落生长的孔数。

式中EW为无集落生长的孔数，TW为总孔数，n为每孔接种细胞数（2 000），PE2为表达培养2 d的平板效率。

1.2.8 致突变能力比较 当受试物有致突变阳性作用时，将卷烟烟气各剂量的TMF绘制剂量-反应关系曲线，直线部分的斜率即为致突变强度。直线部分的选择依据SPSS 17.0统计分析，首先对TMF数据进行一元二次（一元二次方程为ŷ=a1x2+b1x+c1）线性拟合。二次项系数a1用于评价模型的显著性，当a1有明显显著性时，去掉高剂量数据，剩余数据再进行一元二次线性拟合，直至a1无显著性。对剩余数据进行一元直线（ŷ=b2x+c2）回归模拟，其中，b2为致突变强度[8]。

2 结果

3种卷烟样品信息及烟气冷凝物的常规化学分析数据见表1，实测的焦油含量和烟碱含量与盒标一致或低于盒标。

表1 3种卷烟样品的信息及烟气冷凝物的常规化学分析数据

3种卷烟样品的烟气冷凝物TK基因突变试验结果见表2，阳性对照CP的TMF显著高于溶剂对照组（P＜0.01）。随受试物剂量增加，RSG和RTG呈下降趋势，表现出良好的剂量-反应关系。1号样品在剂量为150 μg/mL、2号样品和3号样品在剂量为100μg/mL时，TMF是溶剂对照组3倍以上，并且随着CSC剂量的增加，TMF呈上升趋势。在本试验条件下，CSC对L5158Y细胞的TK基因有致突变作用。3种卷烟样品的TK基因致突变强度分别为0.37、0.36和0.38，表明卷烟烟气的TK基因致突变能力与焦油释放量无明显相关关系。

3 讨论

卷烟烟气含有多种遗传毒性有害成分，如4-（N-甲基-N-亚硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮、苯并芘等，目前国内外从基因突变[10-11]、染色体和染色体组畸变[12-14]、DNA损伤[15-16]等方面来评价卷烟烟气的遗传毒性。国际烟草科学研究合作中心烟草烟气体外毒性测试工作组推荐采用Ames试验和体外微核试验来评价卷烟烟气的危害，但仅采用这两种遗传毒性试验是不全面的。

表2 卷烟样品烟气冷凝物的TK致突变频率测定结果

国际上至今已发展了使用不同生物材料的多种类型体内、体外遗传毒性测试试验，经济合作与发展组织有指导方针的遗传毒性试验共15项。这些试验各具优缺点，但尚未发现单一的一种试验在检测终点覆盖范围、灵敏度和特异性等方面均能达到令人满意的程度。因此，国内外均一致认为只有使用一组试验方法才能对受试物的遗传毒性作出较为可靠评价。与其他常用的短期致突变试验相比，TK基因突变试验检测的遗传学终点非常丰富，可检出的遗传毒性包括点突变、缺失、置换、基因增殖、杂合等多种遗传学损伤，这是Ames试验和体外微核试验无法比拟的。同时该试验具有高灵敏度和简便易行等特点，也是欧盟、美国和中国在药物、食品安全性评价时的必选或备选遗传毒性试验方法。

TK基因突变试验是Clive和Spector于1975年创建的方法，利用突变细胞对嘧啶类似物表现出抗性而存活的特点对TK突变体进行选择，从而检测化学物或其他环境因素的诱变性[17]。卷烟烟气在多种遗传毒性试验中表现出阳性作用[2]，TK基因突变试验发展的完善，使得国际上开始采用TK基因突变试验来检测卷烟烟气的致突变性，美国FDA曾于2011对1种参比卷烟和10种市售卷烟进行小鼠淋巴瘤细胞的TK基因致突变试验，结果发现，11种卷烟的烟气冷凝物均表现出致突变作用，同时发现致突变强度与焦油释放量无相关关系[8]。本研究也发现焦油释放量的增加，并未直接导致卷烟烟气致突变能力的增加，这在流行病学的研究中得到了支持，这些研究表明，抽吸中焦油（14.5 mg）、 低 焦 油 （6.5～14.5 mg）和 超 低 焦 油 （＜6.5 mg）[18-19]吸烟者的致肺癌物质的暴露和患肺癌风险无明显差别，表明卷烟烟气的遗传毒性并不单纯依赖于焦油量影响。事实上，卷烟烟气含有100多种有害成分，而焦油中的有害成分可能因烟草特性、卷烟的物理及化学特征及吸烟行为而异（即吸烟者的抽吸次数、抽吸体积及抽吸持续时间等）[20]。

总之，本研究表明，小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验可以评估卷烟烟气的遗传毒性，同时，卷烟烟气对TK基因的致突变能力与焦油释放量无明显相关关系。