纳米TiO 2对子代大鼠免疫系统的毒性研究

凌 敏，杨明晶，梁 婕，陈东亚，张 薇，卞 倩*

（江苏省疾病预防控制中心毒理与风险评估研究所，江苏 南京 210009）

纳米二氧化钛（nano-TiO2）因具有较好的光催化活性、抗紫外线、强表面吸附能力和特殊的光电效应等特性，已被广泛应用于涂料、纤维、塑料、油漆、精细陶瓷、化妆品和食品等领域[1-4]。常规尺度的TiO2被认为基本无毒，其已获得美国食品药品管理局（FDA）批准为食品添加剂使用[5]。而由于nano-TiO2粒径小，因此理化性质会表现出不同于常规粒子的特性，进入机体后能引起不一样的生物学效应[6]。现在国内外研究越来越关注nano-TiO2的安全性及潜在毒性。研究发现nano-TiO2对免疫系统、神经系统、呼吸系统、心脏和肝肾等器官及对哺乳动物生殖发育均产生一定的影响[4-5，7]。因此，对nano-TiO2生物安全性的评估和研究具有重要现实意义。本研究通过扩展一代繁殖试验（OECD 443）观察nano-TiO2暴露对F1子代大鼠免疫功能的影响，为nano-TiO2的安全性评价提供基础毒理学数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品

13周龄SPF级SD大鼠90只，雄性30只，雌性60只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011号。实验在江苏省疾病预防控制中心毒理与风险评估研究所动物实验室进行。屏障环境实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2017-0031号。实验室温度20～24 °C，湿度40%～70%。实验期间动物自由饮水、摄食。粒径为5～30 nm的nano-TiO2购自美国Nanostuctured and Amorphous Materials公司，由国家食品安全风险评估中心提供。用灭菌水配置成25 mg/mL的nano-TiO2混悬液，实验前用超声处理器进行超声分散。

1.2 主要仪器及试剂

Accuri C6流式细胞仪（美国BD），Scientz-II D超声波细胞破碎机（宁波新生物科技股份有限公司），ADVIA®2120血细胞分析仪（德国Siemen），细胞筛、红细胞裂解液、CD3/CD4/CD8大鼠流式检测抗体、CD3/CD45RA/CD161a大鼠流式检测抗体（美国BD），1640培养基（美国Gibco），绵羊血红细胞（南京森贝伽生物科技有限公司）。

1.3 实验动物分组及处理

雌、雄大鼠适应3 d后分性别按随机方法分入各组，对照组和nano-TiO2组均为45只，其中雄性大鼠15只，雌性大鼠30只。nano-TiO2组每天按10 mL/kg灌胃给予25 mg/mL的nano-TiO2混悬液1次，对照组每天灌胃给予等体积生理盐水。灌胃2周后，同组大鼠按雌∶雄为2∶1比例于晚上合笼，次日早晨进行阴栓及阴道涂片检查。每组保证至少20只孕鼠。各组雌鼠在交配期、妊娠期和哺乳期继续灌胃染毒，直至子鼠离乳。雌鼠在子鼠离乳后处死。子鼠从离乳到出生后56 d（PND56）持续每天灌胃1次染毒。PND56子鼠处死后称体质量，收集肝、脾脏和胸腺，计算脏器系数[脏器系数=脏器质量（g）/动物体质量（g）×100%]，并进行脾和潘氏淋巴结分型和抗体生成细胞检测。

1.4 脾和潘氏结淋巴细胞分型检测

每组随机选取10只子鼠，雌雄各半。颈椎脱臼处死后，迅速取脾和小肠潘式淋巴结后将其放入盛有5 mL 1640培养基的平皿中，用注射器针头划碎，然后经细胞筛过滤，300 g离心5 min，弃上清。加入2 mL红细胞裂解液裂解5～10 min后，300 g离心5 min，用无菌PBS洗3遍，悬浮于1～2 mL 1640完全培养基中。经CD3/CD4/CD8和CD3/CD45RA/CD161a大鼠流式抗体染色后上流式细胞仪进行淋巴细胞分型检测，得出T细胞、B细胞、NK细胞比例及计算CD4/CD8阳性细胞比值。

1.5 抗体生成细胞检测

用生理盐水将无菌脱纤维绵羊血细胞浓度调整为5×109个/mL，每组随机选取10只子鼠，雌雄各半，腹腔注射绵羊血红细胞（SRBC）0.4 mL致敏。免疫5 d后，将子鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，制成单细胞悬液，进行溶血空斑试验。计数溶血空斑数，用每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数来表示抗体生成细胞数。

1.6 统计学方法

实验结果数据用xˉ±s表示，采用SPSS 13.0软件进行t检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 Nano-TiO2对子代大鼠免疫器官脏器系数的影响

由表1可见，与对照组比较，nano-TiO2组雌鼠脾脏系数升高，而雄鼠肝脏系数降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。其余观察指标与对照组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 Nano-TiO2对F1代子鼠免疫器官脏器系数的影响（x±s，%，n=20）

2.2 Nano-TiO2对子代大鼠脾和潘式结淋巴细胞分型的影响

见表2和表3。与对照组相比，nano-TiO2组脾和潘式结淋巴细胞分型结果差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 Nano-TiO2对F1代子鼠脾淋巴细胞分型和脾抗体生成细胞数的影响±s，n=10）

表2 Nano-TiO2对F1代子鼠脾淋巴细胞分型和脾抗体生成细胞数的影响±s，n=10）

性别雌性雄性组 别对照组nano-TiO2对照组nano-TiO2 CD4/CD8阳性细胞比值1.67±0.38 1.69±0.33 1.78±0.32 1.76±0.28 B细胞比例/%50.27±4.28 47.88±3.18 47.83±5.21 49.06±4.36 T细胞比例/%31.25±3.22 32.31±2.59 31.32±3.38 27.84±3.84 NK细胞比例/%10.34±2.43 11.51±1.13 10.55±1.79 10.72±0.91空斑数203.0±94.6 292.7±164.2 224.9±95.0 249.8±82.7

表3 Nano-TiO2对F1代子鼠潘式结淋巴细胞分型的影响s，n=10）

表3 Nano-TiO2对F1代子鼠潘式结淋巴细胞分型的影响s，n=10）

性别雌性雄性组 别对照nano-TiO2对照nano-TiO2 CD4/CD8阳性细胞比值4.18±0.53 3.59±1.37 3.59±1.12 3.45±0.61 B细胞比例/%47.61±7.61 54.27±8.54 35.32±6.76 33.09±9.64 T细胞比例/%27.56±3.54 26.18±4.37 26.82±6.82 25.18±6.01 NK细胞比例/%2.08±0.55 2.05±0.49 2.03±0.58 2.19±0.55

2.3 Nano-TiO2对子代大鼠脾抗体生成细胞数的影响

由表2可见，抗体生成细胞检测试验结果显示nano-TiO2组子代大鼠溶血空斑数与对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

随着纳米技术的发展，纳米材料广泛应用于食品、制药、电子产品、化妆品、添加剂等领域[8-9]。纳米颗粒（1～100 nm）由于其在纳米尺度下，会呈现出不同于其分子形式的物理化学性质[10]。纳米颗粒进入生命体后产生一系列的生物学效应与常规尺度的物质不同，它可通过与生物体的蛋白、核酸分子及细胞相互作用，而产生生物毒性，如呼吸毒性、生殖毒性、神经毒性等[11-13]。近年来，随着人们接触纳米材料的机会越来越多，因此其对人体健康及环境带来的潜在危害也引起了广泛的关注。

免疫系统对于机体防御病原体的入侵和维持机体自身的稳定状态具有非常重要的作用及意义，往往动物在早期或小剂量接触毒物时，机体其他系统还未受到损害，免疫系统就会先受到影响[14]。机体免疫由特异性免疫和非特异性免疫组成。特异性免疫应答包括细胞免疫与体液免疫，T细胞主要介导机体的细胞免疫，B细胞是体液免疫的主要细胞[15-16]。而T细胞又分为CD4+和CD8+T淋巴细胞，正常情况下，这两种细胞保持在一种平衡状态下，CD4/CD8阳性细胞的比值可直接反映机体免疫状况，是维持机体健康的重要指标[17-18]。

Fu等[19]采用气管滴注nano-TiO2对SD大鼠进行染毒，染毒组剂量分别为0.5、4和32 mg/kg，每周2次，连续28 d，结果发现，nano-TiO2对大鼠免疫细胞及器官有一定影响，随着染毒剂量的增加，B淋巴细胞数量增加，但是T细胞亚群数量和NK细胞数量与对照组相比无显著差异；病理学显示，高剂量组肺泡腔内和淋巴结可见纳米棕色颗粒和团块物质沉积，脾和胸腺未见异常。Wang等[20]用5 g/kg的nano-TiO2对小鼠进行1次灌胃染毒，14 d后观察发现nano-TiO2可在脾脏蓄积，但并未发现脾脏的病理学改变。Park等[21]用20 mg/kg nano-TiO2对小鼠进行经口灌胃染毒，脾淋巴细胞分型结果发现，与对照组相比NK细胞、B细胞增加，而T细胞减少，CD4/CD8阳性细胞比值下降。Sang等[22]发现将不同浓度（2.5、5 和 10 mg/kg）nano-TiO2对小鼠持续灌胃90 d，小鼠外周血内CD3+、CD4+、CD8+和B细胞和NK细胞量，以及CD4/CD8阳性细胞比率较对照组降低。这些研究表明不同浓度和作用不同时间的nano-TiO2暴露会攻击实验动物的免疫系统，使其受到不同程度的损伤。

由于纳米粒子容易自发凝聚，表现出强烈的团聚性，而失去纳米粒子所具有的特性。在本实验室条件下，我们通过超声分散的方法使nano-TiO2在灭菌水中保持纳米特性且稳定性在一周内保持良好，25 mg/mL为能达到的最高配制浓度。本研究用25 mg/mL的nano-TiO2混悬液对亲代大鼠及子鼠进行灌胃染毒（灌胃体积为10 mL/kg），结果发现nano-TiO2组F1子代雌鼠脾脏及雄鼠肝脏相对质量与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但由于病理学检查未发现异常，且不存在性别一致性，相对质量数据的变化在本实验室历史数据及文献报道范围内，因此认为差别无生理学意义。但机体免疫功能的改变通常发生在器质性改变之前，因此，我们进一步检测了子代大鼠脾和潘氏结淋巴细胞分型。与对照组相比，Nano-TiO2组脾与潘式结淋巴细胞分型结果差异均无统计学意义，提示nano-TiO2对子代大鼠B细胞和T细胞亚群的稳定性无明显影响。

溶血空斑试验是一种体外检测抗体形成细胞的方法，是国际上一致认可检测体液免疫较为敏感且有效的指标，通过计数抗体形成细胞的数量可以反映对小鼠B细胞活化的能力和抗体生成的能力，从而评价对机体体液免疫的影响[17，23]。本研究结果显示与对照组相比，nano-TiO2组F1子代雌雄大鼠溶血空斑数均无显著变化（P＞0.05）。提示在 250 mg/kg 剂量下 nano-TiO2对子代大鼠体液免疫功能无明显影响。

综上，本研究通过一代繁殖毒性扩展试验探讨nano-TiO2对子代大鼠免疫功能的影响，旨在为nano-TiO2生物安全性的评估提供有益参考，为日后制定相关nano-TiO2使用规范的国家标准和纳米材料毒性评估提供理论依据。根据本研究结果发现，nano-TiO2在250 mg/kg剂量下，未发现对F1子代大鼠免疫功能产生异常影响。