小鼠肝再生过程中Mn SOD作用的初步研究

李 鸽，王耀斐，干 娜，贺 琪，王 冠，韩占锋，海春旭，蔺兆星，*

（1.陕西省地方病防治研究所皮肤性病防治研究室，陕西 西安 710003；2.空军军医大学军事预防医学系毒理学教研室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，陕西 西安 710032）

肝脏有强大的再生能力，肝再生过程很迅速，在临床上进行肝移植后，供体和受体的肝脏一般在术后都能通过再生恢复各自的体积[1]。然而，在急性和慢性肝损伤情况下，肝脏的再生能力可受到严重抑制，进而导致肝功能衰竭[2-3]。目前治疗肝功能衰竭唯一有效的方法是肝移植，但肝移植仍面临供体来源不足和免疫排斥等诸多问题[4]。因此，研究肝再生的分子机制对于肝功能衰竭的治疗和再生医学的发展意义重大。目前认为有很多分子和信号通路参与了肝细胞再生过程[5-7]，但肝再生的机制仍不完全清楚。自1931年Higgins首先建立了经典肝切除（partial hepatectomy，PH）模型后，30%和70%肝切除术被广泛地用于研究肝再生[8-9]。近年研究发现，虽然30%和70%肝切除后肝脏体积都能恢复，但再生的机制不同。30%肝切除术后，肝细胞体积增加，但不进入细胞周期，增生的肝细胞足以恢复肝体积；而在70%肝切除术后，肝细胞最初的反应是细胞体积增大，随后启动细胞增殖，通过分裂来增加细胞数量[4]。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一大类在分子组成上含有氧但化学性质比氧活泼的物质的总称[10]。ROS除了引起氧化应激，还广泛参与细胞分化、增殖、免疫等过程[11]。近年文献报道ROS还可能是启动肝再生的关键因素[12]。锰超氧化物歧化酶（manganese-dependent superoxide dismutase，MnSOD）是超氧化物歧化酶家族中唯一一个维持需氧器官生存的必要蛋白，主要负责清除线粒体内自由基，是保护组织和细胞抗氧化应激的关键酶。在正常人体中，活性氧的生成主要是作为线粒体内电子传递链的副产品，线粒体基质中的MnSOD的作用机制是催化超氧阴离子自由基的歧化反应，将之转化为过氧化氢和氧，最后过氧化氢在谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化物酶家族的作用下降解为水和氧气。MnSOD可以有效地清除细胞中的ROS，保护其免受ROS的损伤[13]。同时，MnSOD也有调控细胞增殖的作用[14-15]。然而，作为ROS和细胞增殖的调控分子，MnSOD在肝再生过程中的作用并不十分清楚。因此，本研究以BALB/c小鼠为研究对象，通过比较30%和70%肝切除后MnSOD的表达和活性变化，初步探究MnSOD在肝再生过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性BALB/c小鼠38只，体质量18～22 g，由空军军医大学实验动物中心提供。动物饲料由空军军医大学实验动物中心提供，自由饮水。动物实验环境温度为（24±2）℃，相对湿度为（50±10）%，12 h/12 h交替照明和避光。

1.2 主要试剂及仪器

Isoflurane购自RWD瑞沃德公司；RIPA裂解液购自碧云天生物科技有限公司；DTT购自Sigma公司；Western Lumax Light Peroxide购自ZETA公司；Hoechest及DHE染料购自Sigma公司；兔抗鼠tubulin单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗鼠MnSOD单克隆抗体购自Cell Signaling公司；BCA蛋白定量分析试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；MnSOD活性检测试剂盒购自Beyotime公司；R510-11 JJsoflurane小动物麻醉机及吸收过滤器，均为RWD瑞沃德公司产品；SCIENTZ-48高通量组织研磨器为Scientz新芝公司产品；Universal HoodⅡ凝胶成像系统、Mini-PROTEAN电泳系统、蛋白半干转装置、蛋白核酸测定仪（Smartspec Plus）、实时荧光定量PCR仪，均为Bio-Rad公司产品；FastKing cDNA第一链合成试剂盒和SuperReal PreMix Plus试剂盒均购自Tiangen公司；BX51正置荧光显微镜及fluoFV10i激光共聚焦显微镜，均为Olympus公司产品；全自动高速冷冻离心机为Sigma公司产品；Infinite M200 PRO全波段酶标仪为Tecan产品。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组和处理 将实验小鼠38只随机分为3组：30%肝切除术组和70%肝切除术组，每组各18只；同时对2只小鼠施行假手术作为对照。假手术组只打开腹腔并不进行肝切除；肝切除术组行肝切除术后继续喂养，由于小鼠在肝切除术后肝细胞迅速增殖，并在1周内逐渐恢复，因此分别于肝切除后术后6 h和1、2、3、5、7 d处死小鼠。

1.3.2 动物造模 小鼠置于小动物麻醉机中使用异氟烷吸入麻醉，各组小鼠参考Higgins和Aderson的大鼠肝切除模型施行肝部分（30%和70%）手术切除，并根据预实验基础对手术方法进行改良。小鼠麻醉后开始备皮，酒精消毒，取上中腹切口，逐层入腹，用手轻轻将小鼠肝左侧叶挤出，轻轻提起，小心离断肝脏周围韧带，4-0线置于肝蒂根部并结扎肝蒂，然后切除肝脏左侧叶，剪断线头，此过程为30%肝切除术。用手轻轻将小鼠肝左侧叶挤出，再缓慢将肝脏中叶旋出，小心离断肝脏周围韧带，4-0线置于肝蒂根部并结扎肝蒂，然后切除肝脏左侧叶及肝脏中叶，剪断线头，此过程为70%肝切除术。检查有无活动性出血，全层连续缝合切口，手术结束。

1.3.3 动物处死 在异氟烷麻醉条件下处死动物，迅速摘取小鼠肝组织，保存于-80℃冰箱中。

1.3.4 肝组织活性氧水平检测 制备厚度为10μm的新鲜肝组织冰冻切片，向肝组织滴加含10μmol/L DHE及10μmol/L Hoechst染料的PBS 500μL，将切片置于湿盒中，在37℃避光条件下孵育20 min，孵育完毕使用预冷的PBS洗3次后吸干水分，甘油封片，迅速于激光共聚焦显微镜下观察结果、采集图像后使用Viewer软件进行定量分析。

1.3.5 实时荧光定量PCR检测MnSOD mRNA的表达 采用Trizol试剂盒抽提小鼠肝组织总RNA，用核酸定量仪测定RNA浓度和260 nm/280 nm处的吸光度比值D（260）/D（280）。初步确定总RNA的浓度及纯度，比值在1.6～1.8之间时可用于反转录。然后用DNase I去除总RNA中的基因组DNA。将RNA稀释10倍后按照快速反转录试剂盒FastQuant RT Kit（With gDNase）操作程序反转录合成第一链cDNA。按照设定的反应体系和反应程序，检测各组织中MnSOD mRNA的转录水平。实时荧光定量PCR仪设置聚合酶链反应（PCR）程序如下：变性（95 ℃、15 min）；延伸（95 ℃、10 s，57 ℃、20 s，72 ℃、32 s）；退火（72 ℃、10 min）。循环44次。应用比较CT法进行相对定量。Real time PCR总反应体系（20μL）为：cDNA模板1 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，RNase-Free ddH2O 7.8μL，同时设置阴性和阳性对照，每个样品设3个重复孔。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用生物凝胶层析100（RAD）进行扫描，并用定量软件进行分析。所用引物的序列为：MnSOD，正向5'-GGC ACCTTTCTCAGTAGCGG-3'，反向5'-CTAAGGGACC CAGACCCAAC-3'；β-actin，正向 5'-ATCATGTTTG AGACCTTCAACA-3'，反向 5'-CATCTCTTGATCGAA GTCCA-3'。引物序列由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3.6 MnSOD蛋白含量检测 肝组织经过相应处理后，采用Western blot检测相关蛋白水平。具体过程：取少量蛋白用BCA蛋白定量试剂盒，测定蛋白浓度，以总上样量为20～30μg计算上样体积。蛋白样品与等量2×上样Buffer混匀后煮沸5 min，冷却后离心混匀。根据不同相对分子质量，采用浓度分别为7%、10%及12%的浓缩胶，按计算好的体积上样后，150 V电泳60 min。用转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，弃封闭液，TBST洗膜后加入相应的一抗溶液，4℃摇床孵育过夜。用TBST洗膜3次，5 min/次。5%脱脂牛奶稀释相应的辣根酶二抗，室温孵育2 h，TBST洗4次，5 min/次。发光液均匀覆盖膜后，凝胶成像系统进行拍照，并使用Quantity One软件对条带成像进行定量分析。

1.3.7 MnSOD酶活力检测 以预冷的生理盐水为匀浆介质（肝组织100 mg：生理盐水0.9 mL）在冰上机械匀浆后于高通量组织研磨器自动匀浆，匀浆液在4℃、4 000 r/min，离心10 min，取上清。稀释样品后进行BCA蛋白定量从而确定蛋白需要量，分别加入抑制剂A和抑制剂B。采用碧云天生物科技有限公司生产的CuZn/MnSOD活性检测试剂盒（WST法）配制WST-8/酶工作液和启动液，严格按照试剂盒内说明书操作，检测肝匀浆中MnSOD酶活力。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计分析软件，实验数据以xˉ±s表示，各实验组间的比较使用单因素方差分析（Oneway ANOVA），各实验组与对照组之间的比较使用Dunnett’s t检验，以α=0.05为检测水准。

2 结果

2.1 肝切除后小鼠肝组织ROS水平的变化

检测30%和70%肝切除后不同时间的ROS水平，使用Viewer软件定量分析后发现，两组肝切除模型的ROS变化不同。见图1。30%肝切除模型中，相比假手术对照组，在6 h后ROS水平显著升高（P＜0.05），1 d后开始下降（P＜0.05），第2～7天恢复至对照组水平（P均＞0.05）；在70%肝切除后6 h无明显变化，第1天开始ROS显著增加，一直持续至第5天（P均＜0.05），第7天ROS水平降低，与对照组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 肝切除后小鼠肝组织MnSOD mRNA水平的比较

检测30%和70%肝切除后MnSOD mRNA水平发现，两者变化趋势相反。30%肝切除术后第6小时和第1天MnSOD mRNA含量显著增加（P均＜0.05），而第2天降至对照组水平，第3天和第5天又逐渐增加（P均＜0.05），在第7天恢复至对照组水平。70%肝切除后MnSOD mRNA的水平逐渐降低，第2天降至最低值（P均＜0.05），第3天开始增加，但仍低于对照组（P＜0.05），至第5天和第7天增至对照组水平。见图2。

图1 30%和70%肝切除后小鼠肝组织中活性氧的变化

图2 30%和70%肝切除后小鼠肝组织中MnSOD mRNA的变化

2.3 肝切除后小鼠肝组织MnSOD蛋白表达水平

用Western blot法检测MnSOD蛋白的含量发现，在30%肝切除组中，与对照组相比，肝切除后各时间点MnSOD的蛋白含量均未发生明显变化（P均＞0.05）；而MnSOD水平在70%肝切除组中变化明显，相比假手术对照组，术后第6小时其含量变化不明显（P均＞0.05），第1～3天逐渐下降，在第3天降到最低值，第5天开始增加（P均＜0.05），于第7天恢复至对照组水平。见图3。

图3 30%和70%肝切除后小鼠肝组织中MnSOD蛋白水平的变化

2.4 肝切除后小鼠肝组织MnSOD的酶活力比较

30%和70%肝切除后MnSOD的酶活力变化不完全一致，前者在术后第1天酶活力增强，达到最高值，第2～3天下降，第3天降至最低，并低于对照组活力，第5天酶活力开始恢复（P均＜0.05），第7天增加至对照组水平（P＞0.05）；而后者在术后第6小时增至最高，第1～5天酶活力逐渐下降（第3天已低于对照组），第7天开始增加，但仍低于对照组水平（P均＜0.05）。见图4。

图4 30%和70%肝切除后小鼠肝组织中MnSOD酶活力的变化

3 讨论

正常生理状态下绝大部分肝细胞处于静息状态，但在受到感染、中毒或部分肝切除后，肝细胞进入细胞周期并进行复制，表现出强大的再生能力和功能代偿能力。然而，多种有害因素（病毒、药物和酒精等）不仅引起大量肝细胞损伤坏死，而且还严重损伤肝脏的再生潜能，进而导致肝功能衰竭[9]。临床上重型肝炎肝衰竭患者、肝硬化或者肝癌行肝切除手术者，肝脏再生能力的强弱对于患者的预后具有重要意义[16]。研究发现，肝再生涉及炎症、再生等多个生理病理过程[6，17]，70%肝切除可引起包含30%肝切除后导致的基因改变[18]，而相比较而言70%肝切除后的肝再生过程变化更为显著，因为启动细胞增殖与分裂完成肝再生的是70%肝切除[4]，我们前期研究提示MnSOD可能在肝再生中发挥了关键作用。因此，本研究通过同时建立30%和70%肝切除模型，比较了两种模型中MnSOD的表达变化，初步探究了MnSOD在肝再生过程中的作用。

肝切除后诱发的较高剂量的ROS在肝再生过程中起着重要的开关作用[12]。在本研究中也发现30%和70%肝切除后ROS均明显增加，但两者增加的模式并不相同。30%肝切除后ROS增加迅速，第6小时增加显著，持续时间短，第2天已降至正常水平。而70%肝切除后ROS增加相对滞后，第1天开始增加，但持续时间相对较长，第1～5天均维持高ROS状态。以上结果提示30%肝切除后ROS的增加可能只是一过性应激反应，而70%肝切除后持续增加的ROS可能是肝再生所必需的条件。有文献报道，在70%肝部分切除术后的12 h或更晚，染色质的早期重塑可能通过改变基因的转录启动细胞增殖与分裂[18]。我们在30%和70%肝切除模型中检测了MnSOD转录水平的变化，结果显示30%肝切除早期MnSOD转录增强，第2天恢复正常水平，这与ROS的变化类似，提示这可能是ROS诱发的细胞抗氧化反应，而在第3天和第5天出现的第二个转录增加的机制有待进一步研究。早期文献发现，处于静息状态下的细胞中MnSOD的水平要比处于增殖状态高[19]，而下调MnSOD的水平可以促进细胞增殖[14]。MnSOD起着分子开关作用，可以启动静息细胞进入细胞周期[15]。我们发现70%肝切除后MnSOD转录水平持续下降，这说明MnSOD水平的下调很有可能参与了肝再生过程。

虽然30%肝切除后MnSOD转录出现两个增加时段，但蛋白水平的检测发现MnSOD的含量未发生明显变化，这可能与非编码RNA（non-coding RNA）介导的转录后调控有关。70%肝切除MnSOD的含量下降，与转录变化基本一致，进一步提示MnSOD可能调控了肝再生过程。MnSOD作为细胞内重要的抗氧化酶，我们对其酶活性进行了评估，发现30%肝切除后MnSOD活性第1天增强，这可能是ROS升高诱发的防御性反应，第2天ROS水平正常后，其活性开始下降，在第3天MnSOD活性降至最低后逐渐恢复正常。虽然70%肝切除术后第6小时MnSOD活性也增强，但之后持续下降，第7天仍未恢复正常活性。过高水平的ROS可能导致肝细胞的氧化损伤，因此MnSOD活性的升高清除了部分ROS，而之后MnSOD活性的下调可以使ROS保持在促增殖作用的较高剂量，最终启动细胞分裂。MnSOD蛋白和活性的改变不尽一致可能是因为存在翻译后修饰的现象。Sarsour等[20]在静息状态下可发生MnSOD蛋白第89位赖氨酸的甲基化，这种修饰可以显著增强MnSOD的活性，而在增殖状态下发生的去甲基化使酶活性降低。因此，在有些情况下MnSOD的蛋白水平并未发生变化，但活性可发生很大的改变[15]。

综上所述，我们通过比较30%和70%肝切除后MnSOD表达和活性变化，初步揭示了MnSOD在肝再生过程中的负调控作用，其机制可能与下调表达的MnSOD含量和活性进而导致ROS升高有关。本研究为阐明肝再生的分子机制提供了线索，为临床上治疗肝功能衰竭提供了研究思路和潜在靶点。