肿瘤抑制基因1在宫颈鳞癌及子宫内膜腺癌中的表达

王冠 王莉莉 邢焱玲 王爽 段丽 张慧晶 高洪菊

宫颈癌和子宫内膜癌是妇科常见恶性肿瘤，并且近年来的发病率在持续增长，如果得不到及时有效的治疗，可能会对患者今后的健康和生活产生影响，但是现阶段临床医学尚未明确两种疾病的具体发病机理。此外，尽管部分患者接受了早期的有效治疗，并且做到了对宫颈癌及子宫内膜癌的根治和预后，但是部分患者在治疗之后会出现局部复发或病灶转移的现象，由此可见，研究子宫内膜癌发病机制的重要性[1-3]。宫颈癌及子宫内膜癌病理类型分别以宫颈鳞癌和子宫内膜腺癌较常见。为便于采集病理标本，保证实验数据的准确性，本实验选取的研究对象定位于宫颈鳞癌及子宫内膜腺癌患者。现将结果汇报如下：

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取妇科常见的宫颈癌和子宫内膜癌患者作为本次研究对象。整理收集2017年1—11月我院妇科治疗的30例宫颈鳞癌患者的宫颈病理组织作为研究组1的研究对象，同时相应选取30例经宫颈液基细胞学证实无异常的宫颈病理标本作为对照组1的研究对象。另选取30例子宫内膜腺癌患者的子宫内膜病理标本作为研究组2的研究对象，同时选取30例子宫平滑肌瘤患者正常子宫内膜病理标本作为对照组2。所有患者术前均未接受放、化疗等治疗；患者均为已婚已育妇女。

1.2 方法

采用免疫组织化学方法检测宫颈鳞癌及子宫内膜腺癌标本及对照组标本，对其MTSS1的表达情况进行判定。应用实时荧光定量PCR（q-PCR）测引物序列及Western 蛋白印迹法对MTSS1的表达情况进行判定。

1.2.1 免疫组织化学检测方式 选择3μm的组织切片，对其进行脱蜡、水化处理，用pH值为6.0的柠檬酸盐缓慢的冲洗组织切片3 min；随后用蒸馏水冲洗组织切片，PBS冲洗12 min，并在除去PBS每张切片加入MTSS1抗体、Gli1抗体，具体是将组织切片放置在温度为37℃的环境中孵育45 min，随后用蒸馏水冲洗，PBS冲洗12 min，除去组织切片中的PBS后加入第二抗体，将切组织切片放置在温度为37℃的环境中孵育25 min，随后用蒸馏水冲洗，PBS冲洗12 min；在每张组织切片中加入DAB显色液，在室温环境中另其显色3～5 min，随后用蒸馏水冲洗，用苏木素复染冲洗30 s，在其中添加1%盐酸酒精，随后用蒸馏水冲洗，对酒精进行脱水，最终用中性树胶封闭组织切片。并比较两组实验组织中MTSS1和Gli蛋白的表达情况。阳性判断指标[4-5]：患者的MTSS1蛋白在染色后呈现出淡黄色、棕黄色、棕褐色，本次实验研究的每张组织切片最终病理确诊工作均由两位病理医师共同完成，具体应用的是二级计分法，并选择5个高倍视野进行观察，积分元素为染色强度和阳性细胞所占百分比。MTSS1蛋白阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色，定位于胞质中；每张切片均需由两位病理医师观察，采用二级计分法，观察5个高倍视野，具体的染色强度积分指标如下：淡黄色1分，深黄色2分，棕黄色、棕褐色3分；阳性细胞所占百分比积分指标如下：0%～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～5%为3分，超过75%为4分。染色强度和阳性百分比的乘积＞3分为免疫反应阳性，按乘积分数将染色结果分为4个等级：0～2分为阴性（-）；3～5分为弱阳性（+）；6～8分为中度阳性（++）；9～12分为强阳性 （+++）。

1.2.2 q-PCR检测 将患者的组织标本分成二份，一份在液氮下磨碎，并用TRIzol 试剂盒提取RNA，检测RNA在波长260 和280 nm 处的光密（D）值（使用紫外分光光度仪），逆转录成为 cDNA 后，再通过引物进行PCR的扩增，测引物序列[6-7]。

1.2.3 Western蛋白印迹法 选择两份组织标本中经过了液氮冻存的一份，在其中加入蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液，随后将其放在冰上孵育20 min，进行离心操作10 min，取其中的上清，测量其蛋白浓度，按照1∶4的比例混合缓冲液和蛋白样品，随后将其放在沸水中加热5 min，待冷却后进行离心操作30 s[8-9]。选择适量样本进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将其转移到纤维素膜之上，封闭1 h后进行MTSS1抗体孵育，随后将处理好的样本放置在温度为4℃的摇床中一夜，次日用含有0.1% Tween20的TBST清洗样本，将同辣根过氧化物酶标记过的羊抗小鼠IgG二抗放置在室温环境中孵育1 h，最后通过暗室ECL法进行成像。判定标准：MTSS1表达判定以蛋白上样量及曝光强度为依据，如果高于正常宫颈组织和子宫内膜组织（所有正常组织样本等量混匀）视为阳性，反之视为阴性。

1.3 统计学处理

应用统计学软件SPSS17.0分析和统计数据，计数资料应用χ2检验，P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化方法检测MTSS1阳性表达率

研究组1（宫颈鳞癌患者）中MTSS1阳性表达率为 53.33%，对照组1中MTSS1阳性表达率为23.23%；研究组MTSS1阳性表达率明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

研究组2（子宫内膜腺癌患者）中MTSS1阳性表达率为56.67%，对照组2中MTSS1阳性表达率为16.67%。研究组MTSS1阳性表达率明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 实时荧光定量PCR（q-PCR）测引物序列及Western 蛋白印迹法

研究组1（宫颈鳞癌患者）中MTSS1阳性表达率为63.33%，研究组2（子宫内膜腺癌患者）中MTSS1阳性表达率为66.67%。对照组1和对照组2中MTSS1检测显示均为阴性。研究组MTSS1阳性表达率明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 结论

综合国内外研究成果，MTSS1在恶性肿瘤的研究中，已经成为一个重要的肿瘤抑制因子[10-11]。但是在妇科肿瘤领域中，相关报道甚少[12]，本研究应用免疫组化方法结合q-PCR 及 Western 印迹技术检测 MTSS1基因及蛋白在宫颈鳞癌和子宫内膜腺癌组织中的表达水平，两种方法所得结论相同：运用免疫组化方法检测宫颈鳞癌及子宫内膜腺癌MTSS1阳性表达率分别为53.33%和56.67%，明显高于其对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；运用q-PCR及Western 印迹技术检测实验证实，宫颈鳞癌及子宫内膜腺癌MTSS1阳性表达率分别为63.33%和66.67%，MTSS1在宫颈鳞癌及子宫内膜腺癌中的高表达，进一步在蛋白水平证实MTSS1基因的表达可能与其发生发展密切相关。今后如将MTSS1列为日后检查妇科恶性肿瘤标记物之一，则又增加了一种癌症筛查的诊断方法。