铁皮石斛提取物促进肌肉损伤修复作用的机理研究＊

田林娜，李亦凡，林丹丹，范昌健，吴 鹏，卢 娟，陈际名，马 啸,

（1.云南农业大学体育学院 昆明 650201；2.云南农业大学龙润普洱茶学院普洱茶学教育部重点实验室昆明 650201；3.云南省高原特色农业产业研究院 昆明 650201）

铁皮石斛是多年生兰科草本植物，是一种较为常见的中草药，近年来受到诸多媒体的关注后，具有较高的认知度和知名度。铁皮石斛的入药部位多为茎部，高度大约在15-30 cm之间，直径3-7 mm，比较常见的形态为干燥后经加工成为团状，俗称“铁皮枫斗”[1,2]。铁皮石斛中的多糖类组分、石斛碱、芪类及其衍生物、生物碱、氨基酸、微量元素及挥发性成分（烃类、醛类、酮类、烯烃类、醇类、酯类等）等有较强的天然活性，具有增强免疫力、抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等功效，近年来关于铁皮石斛的新功效开发工作也在蓬勃开展。

近年来，随着我国大众体育与全民健身浪潮的兴起、社会体育的推广力度和收接受程度日益加深，人民群众参与社会体育活动的热情高涨，丰富的体育项目与运动方式为其提供多种选择。然而，不同类型的体育项目，其运动强度的不同，势必会对运动者机体带来不可避免的疲劳和损伤现象。EGFR（epidermal growth factor receptor）是一种糖蛋白，是表皮生长因子受体（HER）的一种，上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的酪氨酸激酶型受体。广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR作为细胞生长因子的一种参与了骨骼肌再生过程，并且发挥了重要的再生修复作用。根据2010年版《中华人民共和国药典》记载，铁皮石斛主治筋骨痿软，骨骼肌是重要的运动器官，随着近年来大众运动健身习惯的养成，肌肉损伤预防和损伤恢复成了非常受关注的领域[3-5]。EGFR作为细胞生长因子的一种参与了骨骼肌再生过程，并且发挥再生修复的作用[3-5]。因此，本研究将明确铁皮石斛水提物对C2C12细胞和骨骼肌组织中EGFR的调控作用为目标，探明其对肌肉损伤修复作用的机理具有较强的科学价值和现实意义。。

1 材料与方法

1.1 实验材料

C2C12小鼠成肌细胞来源于美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)，细胞形态贴壁，保管条件为90%FBS(胎牛血清，fetal bovine serum)+10%DMSO（二甲基亚砜，Dimethyl sulfoxide）中液氮冻存，在37℃，5%CO2恒温恒湿培养箱中无菌恒温培养。

实验动物选择采用雄性SD大鼠，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，周龄为8-10周，体质量150±10 g。饲育条件：动物房温度24℃，相对湿度50-60%，外周做隔音处理，正常环境噪音小于80分贝，24小时循环通风换气，光周期的控制为12小时(明)/12小时(暗)，解剖实验操作前禁食12小时,自由饮水。

选用的铁皮石斛原料购于北京云中子商贸有限公司，原产于云南省普洱市。石斛水提取物提取工艺为，首先使用粉碎机将铁皮石斛进行粉碎处理，按照料液比1∶30,80±10℃热水浸出1小时后，使用双层医用纱布进行过滤处理，滤渣保留，按照1∶30、1∶20、1∶10的料液比反复热水浸出3次，之后将全部滤液合并后做离心处理，取上清液；减压浓缩至原液体积的1/6-1/8后，放入冰箱-20℃冷冻处理；使用真空冷冻干燥机对冷冻后的浓缩液进行冷冻干燥，得到干燥铁皮石斛提取物，含水率低于2.5%，产率为15-20%。实验用主要药品和试剂：EGFR抗体（CellSignalingTechnology）、抗坏血酸（维生素C）[6]（阿拉丁）、乙腈（美国TEDIA）、三氟乙酸（德国MERCK）、盐酸（阿拉丁）、氢氧化钠（阿拉丁）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及划痕实验

在细胞培养板中将C2C12细胞接种,先使用含10%牛血清的DMEM培养液进行培养，至60-70%细胞出现汇合后,倒掉培养液,使用PBS进行2次清洗，然后加入含2%马血清的DMEM分化培养液进行分化,体外分化培养C2C12细胞5天后，进行饥饿后加铁皮石斛提取物处理，实验分为空白对照组和不同浓度铁皮石斛提取物组，浓度分别为20、40、80、160 ug⋅mL-1。处理后提取细胞蛋白，用于Western blot分析。

划痕实验前，确认每板细胞计数为2.5×107个。在培养皿中用无菌枪头在每板内沿圆心画一条“一”字，将其分为均匀的两个部分，划线笔直无倾斜。并在培养皿底部作上分区标记，以便拍照观察。使用磷酸缓冲盐溶液冲洗一遍培养皿内细胞，去除划痕划下的细胞。此时记为0 h，在显微镜下观察细胞情况并拍照，拍照完成后，进行加药处理，并将培养皿放入37℃、5%CO2的培养箱内培养，培养2 h后于显微镜下观察细胞迁移情况并拍照[7-9]。

1.2.2 骨骼肌孵育及处理

对大鼠进行颈椎脱位处理后，将其肌肉迅速平缓地从体内取出。肌肉的两端用缝合线捆绑，固定在孵育装置上，静息张力设定为0.5 g，肌肉在7 mL Krebs Ringer碳酸氢盐缓冲液（KRB）中预孵育30分钟，向缓冲液持续通入95%O2-5%CO2的混合气体，并保持温度在37℃。首先进行30分钟预孵育，目的是消除手术过程中对肌肉组织本身直接进行物理接触刺激带来的应激性变化，使肌肉组织内各生理水平尽量恢复到接近于在体内的正常状态。预孵育结束后，之后将肌肉在含有指定浓度铁皮石斛提取物的7 mL新鲜缓冲液中孵育30分钟，以检测目标试剂对大鼠离体肌肉的刺激效果。然后，刺激后肌肉组织立即冻结保存，用于Western blot分析[10]。

1.2.3 Western Blot检测

对冻存的细胞样本和肌肉组织样本进行，进行BCA蛋白定量，在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上配制8%的凝胶，根据蛋白定量结果加样本量，121 V恒压电泳90 min。转膜到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，5%BSA封闭1 h。1∶1000稀释蛋白抗体（一抗），封闭后加入一抗4℃摇床过夜，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗膜3次，每次10 min，再在封闭液中加入二抗(1∶5000-10000辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体)，室温1.5 h。再用PBST洗膜3次，每次10 min。化学发光试剂显色，曝光机中进行曝光。

1.2.4 统计学处理

所有统计数据均采用SPSS软件ANOVA进行显著性分析，P＜0.05有显著性差异，P＜0.01有明显显著性差异。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛水提物对C2C12细胞迁移率的影响

图1 铁皮石斛水提物对C2C12细胞迁移率的影响

C2C12细胞在经过不同浓度铁皮石斛水提物2 h处理后，铁皮石斛水提物（80 ug·mL-1）组的细胞迁移率明显上升（图1.F），与空白对照组相比有显著性差异，差异具有统计学意义（图1）。铁皮石斛水提物40ug·mL-1及160 ug·mL-1组的细胞迁移率略高于空白对照组，但差异不明显（图1.D、H）。综上所诉，铁皮石斛水提物在处理细胞2小时对细胞的迁移效果有一定的促进效果，此效果与铁皮石斛水提物的浓度有关。

图2 铁皮石斛提取物处理2 h后C2C12细胞中EGFR中蛋白表达的影响

2.2 铁皮石斛水提物对C2C12细胞EGFR表达量的影响

EGFR是一种糖蛋白，属于ErbB受体家族的一种，为酪氨酸激酶型受体。广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。因此，我们利用蛋白免疫印迹法对C2C12细胞中EGFR蛋白表达进行分析[11]。

实验结果表明，经铁皮石斛提取物处理后C2C12细胞中EGFR与对照组相比有显著上升(图2)。这个结果说明，铁皮石斛提取物能够有效调控EGFR蛋白的表达，从而起到促进C2C12细胞增殖的作用。

2.3 铁皮石斛水提物对骨骼肌组织EGFR表达量的影响

为了进一步研究铁皮石斛水提物能否增加骨骼肌组织中EGFR表达水平，利用骨骼肌组织离体孵育实验体系（图3），我们用含有铁皮石斛水提物的缓冲液对骨骼肌组织进行孵育处理，通过实验，我们发现与对照组相比，骨骼肌组织经过铁皮石斛水提物处理后其EGFR表达量显著上调（图4）。

3 讨论与结论

图3 骨骼肌组织离体孵育实验体系示意图

图4 铁皮石斛提取物处理后骨骼肌组织中EGFR中蛋白表达的影响

伴随着全面健康热潮，体育爱好者和广大健身群体在从事体育锻炼和运动的过程中很容易忽视对锻炼的强度与时间的把控，不规范的运动方式及过度长时间体育运动都会导致的运动性疲劳和骨骼肌损伤，此类问题已经日益成为运动生理学、运动医学以及运动训练学界研究的热点。同时，因为骨骼肌的疲劳和损伤表观上无法准确评估和实施医疗对策，所以研究而的热点也是一个难点，运动性疲劳及损伤问题主要以肌肉疲劳及损伤为主，而在体育运动中骨骼肌作为躯干和四肢的主要动员肌群，其疲劳以及损伤的问题极其常见，同时也非常关键。骨骼肌一旦发生了运动性疲劳和损伤，会造成人体机体的运动支持器官不能有效和稳定的支持其机能维持在正常水平上，严重影响了对象人群的生活质量和健康预期。特别是因疲劳形成损伤的肌肉组织如果不能得到有效的恢复，会直接导致肌肉收缩速度缓慢，效率降低，缺乏正常的伸展与收缩能力。这会造成从事运动人员的动作不规范，整体不协调不连贯，诱发肌肉二次损伤概率大大升高。同时，运动损伤所带来的不适感与疼痛感也给人们日常生活和工作带来了极大的不便，这也会直接挫伤广大群众参与大众体育活动与全民健身的积极性和热情。所以，除了积极普及大众体育项目与指导群众运动技能之外，通过有针对性的科学研究，利用各种有效手段及时补充损失的机能，使运动所带来的骨骼肌损伤能够快速恢复，增强体育运动的健康促进效果与质量，提高人民群众的整体身体健康水平，已经成为国内外运动生理学和运动医学学者与社会指导员们关注的焦点之一。近年来科学应用天然植物成分的功效性来预防骨骼肌疲劳、促进损伤恢复，增强肌肉力量和柔韧性，增加肌肉耐力，提高协调控制机体各运动部分的能力，从而使人民身体强健成为一个热门课题。近些年，世界上很多科研人员和知名制药企业都在努力尝试研究开发具有抗疲劳、促损伤恢复以及抗衰老功效的药物和保健食品，但目前尚未有特别有效的药物问世。另一方面，传统中药越来越受重视，并且有许多药物都表现出有良好的抗疲劳、促损伤恢复和抗衰老的效果。大部分的药物都有抗氧化、促新生的成分，具有清除因疲劳或老化导致的代谢异常产生过量副产物自由基的功能[12]。

因此，在推进全民参与体育运动的大背景之下，针对肌肉疲劳和肌肉拉伤等常见的运动损伤形式，需要一种安全并有效的方法来缓解和抑制此类情况的发生。随着经济发展、生活水平的提高和老龄化社会的到来，亚健康问题越来越严重，人们对养生保健的关注度也在逐渐增加，对保健食品的需求也愈加旺盛[13,14]。现在，铁皮石斛保健食品功能中以增强免疫和缓解体力疲劳进而拥有较高的知名度和市场占有率，得到消费者的普遍认可。深度研究铁皮石斛功效机理，明确其功效机制，针对运动人群和亚健康人群的不同需求，开发出具有针对性的保健食品，可以开拓铁皮石斛保健食品未来发展的新空间。

当前世界推崇绿色食品、绿色运动，提倡绿色健康的生活方式，但是运动所产生的肌肉损伤问题一直是人们不可回避的难题，本实验明确一定浓度的铁皮石斛水提物能够上调C2C12细胞和肌肉组织中EGFR的表达水平，并能促进C2C12细胞增殖，这个研究发现在健康问题备受关注的现代，很可能成为解决运动引起的肌肉损伤问题的一个契机和重要线索[15-17]。

中医药越来越受到国际的普遍认可，而中医药关联保健食品也必将成为未来国际市场的热点。下一步，我们将继续深入开展铁皮石斛活性成分及相关功能的基础研究，目标定位于开发出具有明确功效成分、确切功效靶点的相关产品，使铁皮石斛相关保健产品得到越来越多国内外消费者的青睐。