基于化学计量学分析的诃子药材高效液相色谱指纹图谱研究＊

梁文仪，亓 旗，梁林金，叶 婷，周 坤，简 平，张兰珍

（北京中医药大学中药学院 北京 102488）

诃子是使君子科榄仁树属植物诃子Terminalia chebular Retz.及其变种绒毛诃子Terminalia chebula Retz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果实[1]，又名诃黎勒，诃梨等，蒙药名为“阿如拉”，泰语称“麻菜果”，主要分布于我国西南等地区，如西藏、云南、广东和广西等。在藏医蒙医药中应用十分广泛，有“藏药之王”之称[2]。临床上用常于治疗久泻久痢，便血脱肛，肺虚喘咳，久嗽不止，咽痛音哑等症[1，3]。诃子含有多酚类、黄酮类、多糖类、萜类和甾醇类等多种化学成分，其中含量最多的是鞣质类，以可水解类鞣质为主[4-6]。诃子具有广泛的抑菌、抗病毒、保肝、抗炎、降血糖、调血脂、镇咳和止痛等多种药理作用[7-11]。

2015版《中国药典》诃子药材项下收载了其性状鉴别、显微鉴别和薄层色谱鉴别，但操作繁琐，费时费力。相关学者对诃子药材中没食子酸、鞣花酸和莽草酸等成分进行了HPLC含量测定方法的建立[12-15]，以及HPLC指纹图谱的建立[16，17]，但未对指纹图谱中蕴含的大量信息进行深入分析，筛选区分不同品质诃子的标志性成分。本实验研究了10个不同来源诃子药材HPLC指纹图谱，采用系统聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）方法，挖掘指纹图谱中蕴含的信息，考察不同来源诃子样品的分类结果，寻找区分不同品质诃子样品的标志性成分，为诃子质量控制及评价提供参考。

1 仪器与试药

Sartorious BT 25S型万分之一电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；LC-1100型高效液相色谱仪（安捷伦公司），DAD紫外检测器；超声波清洗器（北京中晟名科技有限公司，100 W），AK-400A粉碎机（温岭市奥力中药机械有限公司）。

表1 不同批次诃子药材

对照品没食子酸(MUST-17022801)、安石榴苷(MUST-17030501)、柯里拉京(MUST-17033002)、五没食子酰葡萄糖(MUST-17060201)、鞣花酸(MUST-17052603)，纯度均大于99%，购于成都曼斯特科技有限公司；没食子酸甲酯（TN1127CA14），纯度大于98%，购于上海源叶生物科技有限公司。

甲醇、磷酸（Fisher，色谱纯）；屈臣氏纯净水；其余试剂均为分析纯。

10个不同来源诃子样品购自北京市藏医院、安徽亳州药材市场和河北安国药材市场，经北京中医药大学生药系刘春生教授鉴定为诃子Terminalia chebular Retz.的干燥成熟果实。样品来源(表1)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

安捷伦ZORBAX SB-Aq C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0-10 min，3%-6%B；10-25 min，6%-15%B；25-45 min，15%-20%B；45-50 min，20%-22%B；50-60 min，22%-30%B；60-70 min，30%-35%B；70-85 min，35%-37%B；85-90 min，37%-43%B；90-100 min，43%-45%B；100-105 min，45%-90%B。流速1 mL·min-1，柱温35℃，检测波长270 nm，进样量20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液配制

精密称取没食子酸、没食子酸甲酯、安石榴苷、柯里拉京、五没食子酰葡萄糖、鞣花酸适量，加50%甲醇于容量瓶定容，对照品溶液的质量浓度分别为没食子酸0.186 mg·mL-1，没食子酸甲酯0.0096 mg·mL-1、安石榴苷0.182 mg·mL-1，柯里拉京0.0694 mg·mL-1，五没食子酰葡萄糖0.324 mg·mL-1、鞣花酸0.1672 mg·mL-1，避光低温保存。

2.2.2 诃子药材供试品溶液配制

精密称取0.2 g诃子药材（过60目筛）置于100 mL锥形瓶，精密加入60%甲醇50 mL，称重，超声提取1 h，冷却至室温，补足重量。过滤，弃去初滤液，即得供试品溶液。进样前，用0.45 μm微孔滤膜滤过。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取S7诃子药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次。选择17号峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.31%，相对峰面积的RSD均小于2.94%，仪器精密度符合要求。

2.3.1 重复性试验

取S7诃子药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样。以17号峰为参照，共有峰的相对保留时间RSD均小于1.87%，相对峰面积RSD均小于2.97%，说明所建立的方法重复性符合要求。

2.3.2 稳定性试验

取S7诃子药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在制样后0，2，4，8，12，24 h进样。以17号峰为参照，共有峰的相对保留时间的RSD均小于1.67%，相对峰面积的RSD均小于2.97%，说明样品24 h内稳定性良好。

2.4 诃子HPLC指纹图谱建立及相似度评价

分别取10批诃子药材粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液进行测定。采用相似度评价系统（2004A版）对10批诃子药材色谱数据（图1）进行分析。以S7样品指纹图谱为参照图谱，采用“平均数”法生成诃子药材HPLC对照图谱R，标定共有峰17个，选择峰面积较大且稳定存在的17号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。将10批诃子药材指纹图谱与对照图谱R比较，进行相似度计算，10批诃子药材相似度分别为0.984-0.999之间，相似度良好(表2)。

2.5 化学计量学分析

2.5.1 HCA

将10批诃子共有峰峰面积色谱数据导入SPSS 20.0软件中，Z标准化处理后，采用Ward法，以平方Euclidean距离为度量标准，进行系统聚类分析。结果(图2)。根据聚类分析结果，将诃子药材大致分为4大类，I类包括S3、S4、S5；II类包括S7、S8、S9；III类包括S1、S10；Ⅳ 类包括S2、S6。

2.5.2 PCA

图1 不同批次诃子药材HPLC指纹图谱

以10批诃子药材的17个共有峰的峰面积为变量，用SIMCA 13.0软件进行主成分分析，以主成分的特征根和贡献率作为选择主成分的依据。共有5个主成分的特征根大于1，其特征值分别为7.074、3.470、2.205、1.892、1.213，它们的方差贡献率分别为41.612%、20.411%、12.969%、11.131%和7.137%，累积方差贡献率大于93.261%。根据样品主成分得分图（图3），可更直观明显看到10批样品被分为4类，与HCA分析结果一致。

2.5.2 PLS-DA

利用SIMCA 13.0软件建立PLS-DA模型，拟合得到最佳潜变量数为6，模型的R2X、R2Y和Q2Y分别为0.801、0.992和0.889，表明该模型对数据具有较好的拟合和预测能力。在PLS-DA得分图中，样品可很好的区分为4类，与HCA、PCA分析结果一致。VIP图能够反映每个X变量在区分样本时的贡献程度，以VIP＞1为原则，得出5、11、1、10、12号峰可能是区分样品最关键的色谱峰，对样品分类作用较大，经指认，1、5号峰分别为没食子酸、没食子酸甲酯(图4)。

3 总结与讨论

本实验比较了40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇为提取溶剂，结果显示，以60%甲醇为提取溶剂时，所得指标性成分峰面积较大，提取率高。比较了60%甲醇超声提取20 min、40 min、1 h的效果，结果显示，提取1 h的提取率最高，故本实验采用60%甲醇超声提取1 h，作为供试品溶液制备方法。

对样品进行全扫描，以色谱峰数、峰面积和分离效果为指标，比较不同波长下的色谱图。结果表明，270 nm条件下得到色谱峰数目最多且各色谱峰分离良好，因此选定270 nm为检测波长。

表2 不同批次诃子药材相似度结果

图2 不同批次诃子药材聚类分析结果

本研究测定10批不同来源诃子药材的HPLC指纹图谱，采用相似度评价系统对色谱数据进行分析，标定17个共有峰，10批药材相似度在0.984～0.999之间，表明所含化学成分基本相同，差异不大，推测其内在成分含量的差异与产地生态环境、保存方法等因素有关。采用对照品对照的方法指认出其中的7个共有峰，分别为1号没食子酸、4号安石榴苷A、5号没食子酸甲酯、7号安石榴苷B、8号柯里拉京、15号五没食子酰葡萄糖、17号鞣花酸。

图3 不同批次诃子药材PCA得分图

图4 不同批次诃子药材PLS-DA分析结果

主成分分析得分图和偏最小二乘判别分析得分图均将样品分为4类，与聚类分析结果较为一致，说明聚类分析与主成分分析和偏最小二乘判别分析的结合能对指纹图谱进行更好地识别。偏最小二乘判别推测找到色谱峰5（没食子酸甲酯）、11、1（没食子酸）、10、12可能是鉴别诃子样品最主要的色谱峰，可引导发现诃子中起决定性作用的化学成分，从而为其质量评价及资源利用提供数据基础。