基于复杂网络的中药半枝莲系统生物学信息挖掘方法＊

胡晨骏，何 菊，谢佳东，房裴裴，丁有伟，胡孔法，冒宇清

（南京中医药大学信息技术学院 南京 210023）

半枝莲（Scutellaria babarta D.Don），别名，狭叶韩信草，牙刷草等，其名最早见于《外科正宗》，为唇形科植物半枝莲的全草，其味辛、苦，性寒，归肺、肝肾经，有清热解毒、散瘀止血、利尿消肿的功能，是一种常用中药[1]。利用高效液相色谱法分析不同产地半枝莲天然化合物成分，共鉴别出100多种天然化合物，主要是黄酮类、二萜类天然化合物成分（表1），其中野黄芩苷含量最高[2，3]。

中医临床上半枝莲是中医组方重要成分，用于各类癌症治疗，如肝癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌[4]。现代药理学发现半枝莲天然化合物有抗肿瘤、增强免疫、抗病原微生物、平喘祛痰、利尿、解热等药理活性[5]。研究发现半枝莲天然化合物成分能调节某些基因表达，如 AHSA1、BCL2L1、CASP3[6]、PRKCG[7]和 TYR[8]。但是目前对半枝莲研究仍然停留在比较基础的层面，临床上仍然以半枝莲复方制剂为主，为了更好发挥半枝莲药用价值，有必要对其进行更深入的研究，阐明半枝莲抗肿瘤活性部位，并且从分子水平研究半枝莲药理活性[9]。

本文采用Herb-Prince复杂网络算法，基于半枝莲天然化合物和系统生物学数据，通过算法推导与半枝莲潜在相关的人类基因、基因族以及KEGG信号通路，从系统生物学特别是基因组学角度挖掘其作用机制，为中医药研究人员从分子水平研究半枝莲药理活性提供决策支持。首先，从HIT数据库[10]中抽取中药、天然化合物、靶点基因的信息，准备半枝莲和靶点基因先验数据；然后，基于StringDB数据库[11]中的人类（Homo Sapiens）蛋白质交互网络（PPIs）信息，通过 Herb-Prince算法计算半枝莲与各个蛋白质节点关联系数；最后，选取Top 100基因进行富集分析，挖掘半枝莲与潜在关联的基因族以及Top 10 KEGG信号通路。检索半枝莲临床与药理学研究文献，验证挖掘得到的基因族和KEGG信号通路信息的有效性，如果半枝莲是组方成分或半枝莲提取物能作用于信号通路或相关生物学过程，则认定该挖掘结果准确。

1 研究方法

1.1 数据来源

半枝莲中天然化合物以及系统生物学数据主要来源于HIT、StringDB、DrugBank。其中天然化合物成分和靶点基因的信息从HIT中抽取，因为HIT数据是经过人工核验的PubMed文献信息，其靶点基因信息源于DrugBank[12]，并人工核验确保数据准确性。因为复杂网络算法准确性直接依赖基础数据的质量，而StringDB整合了多个系统生物学数据源和文献信息，数据全面并且质量高，所以本文PPIs蛋白质交互网络信息从StringDB中抽取，选择物种为人类。本文抽取人类PPIs蛋白质交互网络中有17390个蛋白质节点，并且每个蛋白质节点有相应的标准基因名。基于更多的蛋白质节点数，可以更全面地挖掘与半枝莲相关的系统生物学信息，以下为数据来源信息（表2）。

1.2 复杂网络算法

Prince是以色列科学家Oron Vanunu设计的复杂网络关联分析算法，最初用于分析基因和疾病表型的关系[13]。通过整合中药、天然化合物以及靶点基因信息，也可以将该算法用于中药和基因的关系分析，本文基于Prince算法实现了Herb-Prince复杂网络算法，计算中药和基因关联系数。算法输入参数为半枝莲、靶点基因以及人类PPIs蛋白质交互网络，算法在人类PPIs蛋白质交互网络进行迭代计算，通过蛋白质节点间关系权重，计算半枝莲与蛋白质节点关联系数，从而在网络全局评估半枝莲和每个节点的关联强度。半枝莲与每个节点的关联系数用向量F表示，F的计算公式如下：

表1 半枝莲主要天然化合物成分

表2 数据来源信息

1.3 基因族和KEGG信号通路分析

为了更加深入的理解半枝莲药理作用，本文通过基因族和KEGG信号通路进行富集分析。Prince算法选择关联系数最高的Top 100基因进行分析和验证，本文采用相同的策略。首先，通过HGNC人类基因组数据库平台进行基因族分类[14]，HGNC平台采用树结构来划分基因族，为每个基因族定义“根”符号，采用分级编号来区分子成员，如Caspases基因族，CASP是根符号，CASP1、CASP2、CASP3等成员为叶子节点。因为具有相似核苷酸或蛋白质序列的基因被归为同一基因族，所以基因族成员一般在生化功能上具有相似性，分析关联基因族能预测半枝莲潜在作用的生物学过程。然后，通过KEGG信号通路分析平台，获得半枝莲关联信号通路信息，KEGG是日本京都大学建立了生物信息学数据库[15]，将基因与细胞、物种和系统生物学功能关联起来，其中Pathway数据库整合了各种分子互动网络信息，如细胞过程、新陈代谢、人类疾病、生物体系统等分子互动网络，能全面地展示细胞和生物所包含的系统生物学信息，基于KEGG Pathway数据库，可以挖掘半枝莲潜在作用的人类分子互动网络，为从分子水平分析半枝莲的药理活性提供线索。

2 研究结果

2.1 Herb-Prince算法结果

图1 关联系数百分位数分布情况

半枝莲先验靶点基因是AHSA1、BCL2L1、CASP3、PRKCG和TYR，基于这些先验信息设置初始向量F，通过Herb-Prince算法进行计算，对计算结果进行分析，半枝莲与各蛋白质节点的关联系数取值范围在[3.00E-06，4.07E-03]之间，均值为3.68E-04，筛选Top 100基因的阈值为1.655E-03（图1）。

对蛋白质节点关联系数降序排序，并将其转换为标准基因名，得到Top 100基因（表3）。

2.2 基因族分析结果

通过HGNC分析有四个基因族被识别，每个基因族包含至少四个Top 100基因。四个基因族分别是Caspases、BIRC（Baculoviral IAP repeat containing）、TTC（Tetratricopeptide repeatdomain containing） 、PPI（Cyclophilin peptidylprolyl isomerases）（表4）。

由这四个基因族成员与6个先验靶点基因在StringDB人类蛋白质交互网络中的相关性可知（图2），Caspases和BIRC基因族主要和BCL2L1和CASP3基因相关，基因AHSA1主要与TTC和PPI基因族相关。

Caspases基因族是一种半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡、坏死和炎症中起着至关重要的作用[16]。BIRC基因族在细胞凋亡、细胞因子生成和染色体隔离中都有作用。TTC基因族所表达的TPRs的蛋白质涉及到多种的生物过程，如细胞周期调节、转录控制、线粒体和过氧化物酶蛋白传输、神经发生和蛋白质折叠。PPI基因族蛋白能与免疫抑制药物环孢霉素绑定。如PPID蛋白能与环孢霉素结合，形成环孢霉素与蛋白复合体，以钙调磷酸酶为靶点抑制T细胞信号通路。研究表明半枝莲通过诱导肿瘤细胞凋亡达到抗肿瘤的作用[17，18]，而 Caspases和 BIRC 基因族都在细胞凋亡中起到了重要作用；同时有研究发现半枝莲总黄酮能影响两种肿瘤细胞线粒体[18，19]，TTC基因族成员基因和线粒体生物过程相关。未见直接文献证实半枝莲能调节PPI基因族成员，但有研究发现PPID基因是BCL2基因的协作者，可协同发挥凋亡作用[20]，已有研究表明半枝莲能调节BCL2基因表达[17]，提示可以研究半枝莲对PPID基因族的调节作用。

在以改善生存条件和促进转型发展为特征的一系列试点示范基础上,随着我国经济社会发展和社会福利改进需求的调整,我国可持续城市建设逐渐从关注生存环境、经济转型发展等议题向关注社会的公平、人的发展公平以及社会与环境的协同发展方向转型,可持续城市关注的议题更加综合，更注重人与社会、人与自然、社会与自然的协调发展。

表3 半枝莲关联Top 100基因

2.3 信号通路分析结果

通过KEGG平台，挖掘先验靶点基因信息和Top 100基因可能调节的信号通路，依据信号通路中关联的基因数目筛选出半枝莲Top 10信号通路（表5）。

2.3.1 Apoptosis信号通路

细胞凋亡是指为维持细胞的内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。研究发现从半枝莲中提取的野黄芩素，可以诱导人类结肠癌细胞HCT116凋亡，野黄芩素可以提高细胞内ROS产出，提升HCT116细胞的CASP3基因活性，同时下调BCL2基因表达，并提高BAX基因表达水平[17]，CASP3基因是Apoptosis信号通路中的关键基因。研究者发现半枝莲醇提物通过调节线粒体、Caspases和MAPK相关信号通路诱导人类胃腺癌细胞凋亡[18]。

表4 基因族信息

图2 StringDB中先验靶点基因与基因族成员之间的相关性

表5 Top 10 KEGG信号通路

2.3.2 Pathways in cancer信号通路

该信号通路整合了与癌症有关的信号通路，如粘附、凋亡、血管内皮生长因子、线粒体等信号通路，并包括信号通路之间交互作用。而半枝莲能抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成、增加机体免疫力、抗氧化、逆转耐药细胞株耐药性、抑制端粒酶活性[4]。中医临床半枝莲是一味治疗各类癌症重要药材，常用于治疗肝癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症。本课题组在研究国医大师周仲英肺癌治疗临床医案数据时，发现在2267例病案中半枝莲出现1203次，占比45.1%；在所有病案中包含病机描述的有1090例，第一位病机为痰瘀郁肺的病案共有199例，半枝莲出现161次，占比80-90%。还有研究者分析半枝莲对不同肿瘤细胞的作用机制和抑制效果，如HCT-116[17]、MDAMB-231[21]、A549[22]、H460[22]、CL1-5[23]等肿瘤细胞。

2.3.3 Hepatitis B信号通路

半枝莲归肝经，半枝莲可用于治疗乙肝以及由慢性乙肝引发的肝癌[24]。半枝莲在治疗慢性乙肝中医处方中出现的频次很高，因为其有清热解毒的功效。夏先福在临床上用复方半莲饮治疗乙型肝炎50例，总有效率96%[25]。解长发运用中西医结合治疗乙肝105例，在中医辨证时将病人分为湿热型、脾虚型、脾虚肝郁型、脾肾亏虚型、肝肾阴虚型五种，其中前四种病人类型，在用药方案中都有半枝莲，因为半枝莲药用功效，并对乙肝病毒有抑制作用[26]。药理学研究发现半枝莲醇提液对Hep G 2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达有抑制作用，具有一定的抗乙肝病毒作用[27]。进一步研究发现九种半枝莲天然化合物野黄芩苷、黄芩苷、檞皮素、黄芩黄素和汉黄芩素具有明显的抗乙肝病毒作用[28]。并且半枝莲总黄酮可诱导人类肝癌细胞MHCC97-H凋亡[19]。

2.3.4 PI3K-AKT信号通路

该信号通路在癌症发展过程中起着非常重要，研究人员一直希望通过该信号通路寻求癌症药物治疗新靶点。有研究发现半枝莲可以抑制结直肠癌细胞HCT-8的迁移和入侵，作用信号通路有PI3K-AKT信号通路[29]。半枝莲总黄酮具有抑制小鼠体内黑色素瘤生长的作用，抑制PI3K-AKT和mTOR信号通路相关蛋白表达水平，诱导肿瘤细胞自噬及凋亡[30]。

2.3.5 P53信号通路

P53信号通路在细胞DNA受到损伤时，P53信号通路能触发细胞凋亡或修复。从半枝莲中提取的野黄芩苷能通过P53信号通路抑制人类结直肠癌细胞增殖，诱导其凋亡[31]。半枝莲醇提取物通过调节P53和AKT信号通路，抑制人类结肠癌细胞株增殖[32]。半枝莲对表皮生长因子受体和P53信号通路的定向调控抑制非小细胞肺癌的生长[33]。半枝莲多糖上调抑癌基因P53（TP53）以抑制胃癌细胞SGC-7901的生长活性[34]。

2.3.6 Focal adhesion信号通路

粘着斑激酶信号通路能影响细胞外基质粘附[35]。研究者发现半枝莲对人肝癌细胞株HepG2细胞黏附产生影响，通过MTT法检测各组细胞黏附情况，结果显示半枝莲组与空白组相比，半枝莲组HepG2细胞黏附受到显著抑制[36]。半枝莲总黄酮可能通过改善细胞膜流动性，维持细胞膜的正常功能来发挥抗病毒感染作用[37]。在《中国药典》中收录的中医名方养正消积方[38]，半枝莲是组方中16味中药之一，研究发现该方提取物DEM25能抑制FAK基因相关信号通路的磷酸化，影响肿瘤细胞和间皮细胞之间的粘连以及肿瘤细胞迁移，对腹膜转移有抑制作用[39]。

2.3.7 InfluenzaA信号通路

Influenza A信号通路是与甲型H1N1流感相关。研究发现半枝莲总黄酮对甲型H1N1流感病毒所致的小鼠感染及其导致的死亡表现了一定的治疗或拮抗作用，并且其药效表现了剂量相关特征[40]。相关研究提示半枝莲总黄酮抗甲型H1N1流感病毒作用，可能与半枝莲黄酮类成分抑制病毒对宿主细胞的吸附、抑制病毒复制早期阶段病毒颗粒与细胞内涵体/溶酶体的融合，促进吸附病毒宿主细胞膜流动性恢复，维持细胞膜正常功能有关[40]。有专利申明半枝莲总黄酮成分芹菜素，经体外细胞模型和体内动物模型试验，具有很强抗流感病毒活性[41]。更早期研究发现芹菜素能抑制受感染细胞中流感病毒A/PR/8/34[42]。

2.3.8 其它信号通路

Amyotrophic lateral sclerosis信号通路，没有直接临床和药理研究表明半枝莲能调节该信号通路或相关疾病，但半枝莲总黄酮对其它神经退行性疾病有一定的作用，如阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD），利用脑室注射Aβ25-35联合三氯化铝和RHTGF-β1建立拟AD大鼠模型，引起大鼠神经细胞线粒体凋亡通路中BCL2、BAX和CASP3基因异常表达，而半枝莲总黄酮三个剂量能不同程度地逆转复合Aβ25-35所致大鼠神经细胞异常改变，抑制细胞外β-淀粉样蛋白（betaamyloids protein）沉积形成的老年斑（senile plaque）、抑制细胞内蛋白过度磷酸化形成的大量神经纤维缠结[43]。

Tuberculosis信号通路，有研究分析天然化合物对结核杆菌的抑制作用，发现12种天然化合物对结核杆菌的蛋白酶活性抑制率超过65%，其中有10种天然化合物属黄酮类，包括半枝莲中含有的黄芩黄素（抑制率84.03%）、黄芩苷（抑制率78.47%）[44]。

Toxoplasmosis信号通路，研究者分析了近30年天然化合物的抗弓形虫能力，期望发现新的天然化合物用于治疗弓形虫感染，发现从黄芩中提取的黄芩黄素有很好的抗弓形虫的特点，基于植物学分类方法半枝莲归于黄芩属，同样包含这种天然化合物[45]。有研究发现在体外实验中纯黄芩黄素能抑制弓形虫的生长繁殖效果最好，中药黄芩乙醇提取物效果次之[46]。

Small cell lung cancer信号通路，未发现有研究文献提示半枝莲调节该信号通路。中医对疾病诊断有独特的理论体系，并未采用西医的方法对肺癌进行分类，半枝莲是中医肺癌治疗的重要药物，除周老在肺癌临床组方中使用半枝莲外，以广东省中医院刘伟胜教授在一年内门诊接诊的肺癌病例为研究对象，纳入患者290例，并录入290件病案处方，共有中药148味，发现使用频次最高的为半枝莲（267次）[47]。有研究者通过药理学方法分析半枝莲对人肺巨细胞癌细胞株PG细胞BCL2基因表达的影响，发现经半枝莲含药血清处理后PG细胞BCL2基因表达明显降低[48]。

3 讨论

依据本文的文献验证方法，采用复杂网络方法筛选出的KEGG信号通路，通过已有的临床或药理学研究进行验证，10个KEGG信号通路有7个信号通路，有文献证实半枝莲或半枝莲提取物能作用于信号通路或相应的生物学过程。其它信号通路虽然没有直接文献证实，但是也有文献说明半枝莲或天然化合物成分与这些信号通路或生物学过程有一定的相关性，提示半枝莲潜在的药理作用，对基因族的分析也获得了相近的结论，筛选出的系统生物学信息能为中医药科研人员研究半枝莲的作用机制提示潜在的方向。

在Top 100基因中，经过现代药理学研究发现，这些基因或相关蛋白的表达可以被半枝莲或提取物所调节，如TP53、BID、BAX、BCL2[49]、CASP9[18]、XIAP[50]。但是很多基因没有直接的研究文献提示半枝莲或其提取物可能调节基因或相关蛋白的表达，如SPATA25基因是Top 1基因，SPATA25是精子形成相关基因，该基因在阻塞性无精子症患者表达低于正常人群。中医临床用清毒消炎益肾汤对治疗男性生殖道炎症性不育症300例取得了良好的效果，其基本方中包含半枝莲[51]。用含半枝莲的清精汤治疗精浆AsAb阳性的免疫性不育患者，消除病因时能迅速改善精子发生的微环境，消除AsAb，消除精子凝集，较好地改善精子的各项参数，提高妊娠率[52]。虽然半枝莲被用于治疗炎症性不育和免疫性不育，但是其机理未被进一步的阐释。通过本文挖掘的系统生物学信息，提示研究人员从相关基因、基因族和信号通路分析半枝莲对应的药理活性机制。

在Top 100基因中有10个基因与Focal adhesion信号通路相关，其中PRKCB基因是钙激活的，依赖于磷脂和二酰基甘油的丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶，能对多种生物过程磷酸化水平有影响[53]。现有研究发现半枝莲能抑制人肝癌细胞株HepG2细胞黏附性，并且含半枝莲中医名方能对FAK基因相关信号通路的磷酸化产生影响，结合已有研究和本文挖掘的信息可以推测半枝莲能调节Focal adhesion信号通路中的PKC、SRC等节点（图3）。

4 结论

本文利用复杂网络方法，预测了与半枝莲潜在关联的基因，对相关基因家族和KEGG信号通路进行了富集分析，从系统生物学角度挖掘半枝莲潜在作用机制，并通过文献研究验证分析结果。基于较少的先验信息，本文所预测相关系统生物学信息与半枝莲在中医临床运用和现代药理研究高度一致，为进一步研究半枝莲的作用机制提供帮助。

图3 Focal adhesion信号通路