pH偏移结合温和热处理对蚕豆分离蛋白结构和功能的影响

周向军，董瑞红，高义霞

(天水师范学院 生物工程与技术学院，甘肃 天水，741001)

蚕豆(ViciafabaL.)，豆科巢菜属草本作物，富含淀粉、蛋白质、纤维素、维生素、矿物质、原花色素及异黄酮等生物活性物质。我国是世界上蚕豆种植面积和总产量最大的国家，分别占世界37.3%和32.6%[1]。蚕豆蛋白含量高达25%～30%[2]，仅次于大豆蛋白，含有人体必需的8种氨基酸，其氨基酸组成与人体所必需氨基酸比例接近，是一种优质的植物蛋白资源[3]，被认为未来最有可能取代肉类蛋白[4]。处于极端pH条件下的蛋白质，其分子内部结构首先展开，逐渐调节pH至中性后，可发生重新折叠，即pH偏移。pH偏移可使蛋白质处于变性与未变性之间的熔球态，通常保留变性前大部分二级结构，但三级结构发生较大变化，正逐渐成为食品蛋白质修饰的一种方法。LIU[5]等研究表明，pH偏移结合温和热处理，可使大豆分离蛋白质的胶凝性、表面疏水性和颗粒大小增加，巯基向二硫键转化并形成聚集体且溶解性降低，内源性荧光表明大豆分离蛋白空间结构解体，圆二色谱表明二级结构遭到轻微破坏，该技术有助于改进大豆分离蛋白的功能特性。NIU[6]等研究了天然大豆分离蛋白和pH偏移结合温和热处理后的大豆分离蛋白，以及肌原纤维蛋白热稳定性和成胶性的影响。结果表明，处理后的大豆分离蛋白，可增加肌原纤维蛋白凝胶压力和减少水分损失，处理后大豆分离蛋白可增加氢键和二硫键，原子力显微分析表明，处理后大豆分离蛋白可降低肌原纤维蛋白凝胶的粗糙性、凝胶性和持水力等。

国内有关食品蛋白的研究，主要集中在提取、理化性质、酶解工艺、抗氧化组分及活性肽制备等方面[7-11]，国外则集中在溶解性、乳化性、流变学、胶凝、表面形态、构象和质构等方面[12-17]，有关pH偏移结合温和热处理蚕豆蛋白的研究未见报道。本实验以pH1.5偏移结合25、37和55 ℃温和热处理不同时间后，逐渐恢复至中性，研究蚕豆分离蛋白(broad bean protein isolate，BBPI)溶解性、乳化性、巯基/总巯基含量、紫外和荧光光谱、表面疏水性、二级结构含量和微结构的变化，为BBPI在食品行业的进一步应用提供理论依据。

1 试剂与方法

1.1 材料与仪器

蚕豆蛋白：江苏盐城朱港村五谷行。8-苯胺基-1-萘磺酸钠(ANS)：东京化成工业株式会社；Ellman试剂：BBI；牛血清白蛋白：生工生物工程(上海)股份有限公司；考马斯亮蓝G-250、甘氨酸、尿素、硼酸、DTNB、Tris、EDTA、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和正己烷等均为国产分析纯。

RF-5301PC荧光分光光度计、UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津；722可见分光光度计，上海欣茂有限公司；PHS-3D雷磁pH计，上海精密科学有限公司；TGL-20M型高速台式冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；AL-204型电子天平，梅特勒-托利多有限公司；90-3型定时恒温双向磁力搅拌器，上海亚荣生化仪器厂；KDF-103F自动定氮仪，上海纤检仪器有限公司； JSM-6701F冷场发射扫描电子显微镜，日本电子；Nicolet-iS5傅立叶变换红外光谱仪，美国Thermo fisher。

1.2 方法

1.2.1 BBPI制备

参照曾茂茂的方法[18]，稍作修改。取50 g蚕豆粉，按料液比1∶3(g∶mL)加入正己烷，脱脂2次，5 000 r/min离心15 min，沉淀分散于1 250 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中，调pH 7.5～8.0，40 ℃水浴搅拌3 h，5 000 r/min离心15 min，上清液调pH4.5酸沉，静置过夜。8 000 r/min离心15 min，水洗1～2次，沉淀干燥备用。经凯氏定氮法测定，BBPI蛋白含量为(77.65±0.23)%。

1.2.2 溶解性

0.1 mg/mL牛血清白蛋白0.0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL，分别加入0.1 mg/mL考马斯亮蓝3.0 mL，混匀595 nm测光吸收值。以牛血清白蛋白质量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为Y=10.249X+0.018 3，R2=0.992 5，X为蛋白质量，mg，Y为光吸收值。利用0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液配置5%BBPI，调pH至1.5后，分别在25、37和55 ℃条件下水浴。0、1.5、3.5和5.5 h时，取10～15 mL调pH7.0，混匀静止1 h。搅拌分散30 min后，5 000 r/min离心15 min，稀释后取0.5 mL上清液测光吸收值[19]。总蛋白含量采用凯氏定氮法测定。

(1)

1.2.3 乳化性

利用0.05 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液配置2%BBPI，其余同1.2.2。9.0 mL 2%BBPI与3.0 mL菜籽油混合，均质3 min，立刻在底部吸取60 μL乳化液加至15 mL 0.1%SDS中，振荡混匀后在500 nm测定光吸收值，根据公式(2)计算乳化活力指数(EAI)，10 min后测定光吸收值，根据公式(3)计算乳化稳定性(ESI)[20]。

(2)

(3)

式中:n,稀释倍数,250；ρ,蛋白质质量浓度,g/mL；ω,乳化液中油相体积分数(1/4)；A0,0 min时吸光值；A10,10 min时吸光值；L,比色皿厚度，1 cm。

1.2.4 活性巯基测定

参照卢岩的方法[21]，稍作修改。利用0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液配置2%BBPI，其余同1.2.2。1.0 mL 2%BBPI加入pH 8.0 Tris-甘氨酸溶液8.0 mL，均质后10 000 r/min离心15 min。4.5 mL上清液和0.5 mL 10 mmol/L Ellman(pH 8.0 Tris-Gly溶解)试剂反应，空白含4.5 mL Tris-Gly和0.5 mL 10 mmol/L Ellman试剂，30 min后在412和540 nm测定光吸收值。

活性巯基含量/(μmoL·g-1)= 73.53×(A412-1.693 4A540

+0.009 932)

(4)

1.2.5 总巯基测定

参照李学鹏的方法[22]，稍作修改。利用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液配置2%BBPI，其余同1.2.2。1.0 mL 2%BBPI加入8.0 mL Tris-Gly溶液(含8.0 moL/L尿素)，均质后10 000 r/min离心15 min。4.5 mL上清液和0.5 mL 10 mmol/L Ellman试剂反应，空白为4.5 mL Tris-Gly+0.5 mL Ellman试剂，30 min后412 nm测定光吸收值。巯基摩尔消光系数13 600 L/(mol·cm)，总蛋白含量(c)测定采用凯氏定氮法。

(5)

式中:A,除去试剂空白后样品的吸光值；D,稀释倍数，9；ρ,蛋白质质量浓度,mg/mL。

1.2.6 紫外和荧光光谱

利用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液配置2.0 mg/mL BBPI，其余同1.2.2。以0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液为空白，在270～320 nm范围内进行紫外扫描，制作二阶导数谱。利用0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液配置2.0 mg/mL BBPI，其余同1.2.2。在激发波长281 nm条件下，扫描250～450 nm范围发射光谱，以波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。

1.2.7 表面疏水性

参照KATO[23]法，稍作修改。利用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液配置2%BBPI，其余同1.2.2。0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL上清液，用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液补至4.0 mL，加入50 μL 8.0 mmol/L ANS(0.01 mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液溶解)，混匀静置5 min。在激发波长349 nm，发射波长490 nm，夹缝均为5 nm条件下，测定荧光强度。以荧光强度对BBPI浓度作图，初始段斜率为表面疏水性指数。以时间为横坐标，表面疏水性指数为纵坐标作图。

1.2.8 电镜扫描

利用0.01 mol/L pH7.0磷酸缓冲液配置5%BBPI，调pH1.5后分别在25、37和55 ℃下水浴1.5 h后调pH 7.0，混匀8 000 r/min离心5 min，取上清液。涂片，待干后喷金扫描。

1.2.9 红外光谱分析和谱图处理

1.2.8中处理的BBPI上清液进行真空冷冻干燥。1 mg BBPI与200 mg KBr均匀混合，压片，扫描次数64次，分辨率4 cm-1，增益为1。对光谱进行水汽和二氧化碳校正，扫描范围400～4 000 cm-1，采用DTGS检测器进行红外光谱测定。采用Omnic 8.2软件在酰胺I带范围内(1 700～1 600 cm-1)进行基线校正、去卷积和二阶求导处理，并利用Peakfit 4.12软件对二阶导数曲线拟合至R2≥0.99，根据峰面积计算BBPI二级结构的百分含量。

1.2.10 数据统计

采用SPSS 16.0进行显著性分析(P<0.05)，采用Origin 7.5作图。

2 结果与分析

2.1 溶解性

pH偏移结合温和热处理对BBPI溶解性的影响见图1。蛋白质溶解性取决于疏水作用力、氢键和静电力等分子间作用力，以及pH、盐种类和离子强度等外在因素。pH 1.5结合25、37和55 ℃分别处理0、1.5、3.5和5.5 h后，其时间-溶解度曲线均呈V型曲线。在0～1.5 h范围内时，各组溶解性均出现下降趋势，在1.5～5.5 h范围内时，37和55 ℃处理组溶解性明显增加(P<0.05)，这是因为pH 1.5处理首先使BBPI彻底变性，疏水基团外露，分子间疏水作用迅速增强而成为主要因素，因而溶解性下降。由于BBPI等电点为4～4.2[24]，继续延长处理时间，大部分BBPI带正电荷，分子间斥力逐渐成为主要因素，使BBPI与水分子间作用力增强，因此溶解性增加。与pH 7.0,25 ℃相比，各组溶解性均明显增加，且pH 1.5，55 ℃处理组溶解性最高，这是因为适度增温有利于加大分子扩散而防止聚集，但相应25和37 ℃处理组并未随时间增加呈现明显对应关系。

图1 pH偏移结合温热处理对BBPI溶解性的影响

Fig.1 Effects of pH-shifting and mild heating on solubility of BBPI

2.2 乳化性和乳化稳定性

pH偏移结合温和热处理对BBPI乳化性和乳化稳定性的影响见图2和图3。

图2 pH偏移结合温热处理对BBPI乳化性的影响

Fig.2 Effects of pH-shifting and mild heating on the emulsibility of BBPI

图3 pH偏移结合温热处理对BBPI乳化稳定性的影响

Fig.3 Effects of pH-shifting and mild heating on the emulsion stability of BBPI

当处理时间为0～3.5 h时，各组乳化性开始下降，3.5～5.5 h又逐渐增加。原因可能是经过酸处理后，BBPI形成了类似于“熔球态”结构，即其二级结构相对稳定，但其三级结构发生一定程度变化，且该变化先降低了乳化性，随后由于更多疏水氨基酸的暴露，表面活性开始逐渐增强[25]。与pH 7.0，25 ℃相比，各组乳化性几乎均出现下降，但与温度具有明显的正相关性。与pH 7.0，25 ℃相比，各组乳化稳定性均出现下降，这说明虽然pH 1.5处理可诱导BBPI空间结构逐渐展开，疏水多肽链变得更加松散，但当调节至pH 7.0时，部分展开的BBPI重新相互作用，使乳化稳定性降低[25]。pH 1.5，55 ℃处理组乳化性出现波动，原因可能是其1.5 h后少量BBPI发生聚合作用，随时间延长，界面分子柔性增加又使得乳化稳定性逐渐增强。

2.3 活性巯基和总巯基

pH偏移结合温和热处理对BBPI活性巯基和总巯基含量的影响见图4和图5。对巯基而言，在0～1.5 h范围内，各组巯基含量逐渐增加，此时BBPI内部巯基暴露速度快于新二硫键生成速度。在1.5～5.5 h范围内时，各组变化无明显规律：pH 1.5，25 ℃处理组的巯基含量增加不明显(P>0.05)，这可能是分子内巯基和二硫键交换比较频繁所致，pH 1.5,37 ℃组继续增至最大值，3.5 h后开始下降，pH 1.5,55 ℃组则1.5 h后迅速下降(P<0.05)，这说明适度增温(37和55 ℃)均易加速巯基氧化或巯基与二硫键交换，从而使巯基含量出现下降趋势[26]。

图4 pH偏移结合温热处理对BBPI巯基含量的影响

Fig.4 Effects of pH-shifting and mild heating on sulfhydyyl content of BBPI

图5 pH偏移结合温热处理对BBPI总巯基含量的影响

Fig.5 Effects of pH-shifting and mild heating on total sulfhydryl content of BBPI

对总巯基而言，其含量约为巯基含量10倍以上，原因是长时间极端酸性条件处理，BBPI结构充分展开使内部巯基暴露，也可能是BBPI亚基解离，二硫键断裂生成巯基所致，这与HWANG报道一致[27]。在0～3.5 h范围内，pH 1.5,25 ℃和pH 1.5,55 ℃处理组的总巯基含量变化不明显(P>0.05)，随时间延长，总巯基含量开始下降。而pH 1.5,37 ℃组则在0～1.5 h范围内，总巯基含量先增加，随后明显下降，这说明25和55 ℃处理一定时间后，巯基和二硫键相互转化几乎处于平衡，而37 ℃处理则首先表现为二硫键的氧化程度超过巯基还原，随时间延长，巯基还原程度又逐渐超越二硫键的氧化，因此总巯基含量下降。

2.4 紫外二阶导数光谱

由于Phe、Tyr和Trp在280 nm处均有较强吸收，导致峰信号重叠而难以辨认，因此可利用紫外二阶导数光谱描述其对应的结构变化[28]。pH 1.5偏移结合温和热处理对BBPI紫外二阶导数光谱的影响见图6(25 ℃)、图7(37 ℃)和图8(55 ℃)。在280～300 nm范围内，未处理组BBPI出现两个正吸收峰(289 nm和295 nm)和两个负吸收峰(285 nm和291 nm)。295 nm处正吸收峰是色氨酸的贡献[29]。当pH 1.5偏移结合25 ℃处理不同时间后，BBPI在295 nm处发生1～2 nm红移。随时间延长，峰谷与峰顶距离比(r=a/b)先增加后减小，这表明，pH1.5偏移结合温和热处理后，BBPI三级结构发生一定程度包裹，原来暴露在分子表面的Trp残基重新包裹于BBPI疏水核心[30]。当pH 1.5,37 ℃处理不同时间后，BBPI在295 nm处发生1～2 nm蓝移，且峰谷与峰顶距离比增加，表明部分已暴露的Trp残基开始发生解折叠而暴露于分子表面。pH 1.5+55 ℃处理不同时间后，BBPI在295 nm处未发生明显移动，峰谷与峰顶距离比未有明显规律。

图6 pH偏移结合温热处理对BBPI紫外二阶导数光谱的影响

Fig.6 Effects of pH-shifting and mild heating processes on UV second derivative spectra of BBPI

图7 pH偏移结合温热处理对BBPI紫外二阶导数光谱的影响

Fig.7 Effects of pH-shifting and mild heating processes on UV second derivative spectra of BBPI

图8 pH偏移结合温热处理对BBPI紫外二阶导数光谱的影响

Fig.8 Effects of pH-shifting and mild heating processes on UV second derivative spectra of BBPI

2.5 荧光光谱

pH偏移结合温和热处理对BBPI荧光光谱的影响见图9(25 ℃)、图10(37 ℃)和图11(55 ℃)。各组内源性荧光强度均低于未处理组，这充分说明pH1.5偏移结合温和热处理不同时间后，均可使BBPI分子表面Trp等残基进一步包裹在分子内部疏水核心，即BBPI倾向于重折叠。对pH 1.5,25 ℃组，随时间延长，荧光强度先降低后增强，且发生一定程度红移，这可能是由于BBPI或其亚基在强酸性条件下，部分Trp疏水侧链首先发生暂时聚集，包裹在BBPI分子内部非极性环境中，从而导致荧光强度下降。随时间延长，其又逐渐暴露在分子表面极性环境中，但仍处于不稳定状态。这说明pH 1.5偏移结合25 ℃低温处理时，在0～5.5 h范围内，BBPI色氨酸侧链的聚集或暴露仍未达到平衡。对pH 1.5,37 ℃组，荧光强度先逐渐增加后又明显降低，且均低于未处理组；对pH 1.5,55 ℃处理组，在0～1.5 h范围内，荧光强度显著降低，随后继续增加处理时间，荧光强度降至恒值，这说明pH 1.5偏移处理时，适当提高温度可使BBPI彻底聚集，处理时间不影响荧光强度。

图9 pH偏移结合温热处理对BBPI荧光光谱的影响

Fig.9 Effects of pH-shifting and mild heating processes on fluorescence spectra of BBPI

图10 pH偏移结合温热处理对BBPI荧光光谱的影响

Fig.10 Effects of pH-shifting and mild heating processes on fluorescence spectra of BBPI

图11 pH偏移结合温热处理对BBPI荧光光谱的影响

Fig.11 Effects of pH-shifting and mild heating processes on fluorescence spectra of BBPI

2.6 表面疏水性

pH偏移结合温和热处理对BBPI表面疏水性的影响见图12。表面疏水性反映蛋白质三级结构中表面疏水基团的分布情况，可影响溶解度、吸水性、乳化性和凝胶性等其他功能性质。ANS是一种带负电荷的阴离子探针，在pH 1.5酸性条件下，不仅和蛋白质表面带正电荷氨基酸残基通过静电相互作用而结合，且可蛋白质表面暴露的疏水区域相结合，因此表面疏水性指数不仅反映的是BBPI表面疏水性，同时也反映了ANS与BBPI分子间的静电引力[31]。温度是影响BBPI结构的重要因素，长时间50 ℃以上处理，BBPI分子结构可发生重排，但不同的蛋白质，可能呈现不同规律[32]。总体分析，pH 1.5偏移处理下，BBPI表面疏水性变化较为复杂，表明为其稳定性较差[33]。在0～1.5 h范围内，各组表面疏水性均急剧增加，随时间延长，除pH 1.5,55 ℃组外，其余两组均显著降低，原因可能是当pH 1.5偏移处理后，包裹在蛋白质分子内部的疏水侧链暴露在分子表面，蛋白质疏水性增强，但随时间延长，蛋白质并非只有一种结构模式，BBPI展开后再聚集，依赖于疏水侧链间相互作用而包埋在分子内部[34-35]，从而降低了表面疏水性。在3.5～5.5 h范围内，pH 1.5,55 ℃组表面疏水性反而增加，原因可能是BBPI分子中α螺旋含量较小，约为15%[36]，而有证据表明α螺旋含量可能与温度对表面疏水性指数的影响有关[32]。当温度超过50 ℃时且经过3.5 h长时间处理后，β折叠作为分子间有序排列被不同程度破坏，α螺旋作为分子内有序排列而增强[37]，因而表面疏水性增加。表面疏水性与溶解性几乎呈负相关性，这主要是溶解性取决于BBPI分子亲水性和疏水性的平衡，该平衡又取决于氨基酸组成，特别是分子表面氨基酸组成[34]。NAKAI[38]等研究认为，表面疏水性与乳化性成正相关，本研究结果与其一致。

图12 pH偏移结合温热处理对BBPI表面疏水性指数的影响

Fig.12 Effects of pH-shifting and mild heating on surface hydrophobicity index of BBPI

2.7 二级结构含量测定

不同pH和温和热处理对BBPI二级结构含量的影响见表1。一般情况下，1 600～1 639 cm-1和1 689～1 699 cm-1谱带归属于β-折叠，1 640～1 650 cm-1谱带归属于无规则卷曲，1 651～1 660 cm-1谱带归属于α-螺旋，1 661～1 688 cm-1谱带归属于β-转角[39]。由表1可知，BBPI各二级结构含量依次为：对pH 7.0,25 ℃处理组，β-折叠34.79%，α-螺旋50.63%，β-转角14.59%；对pH 1.5,25 ℃处理组，β-折叠53.07%，无规则卷曲8.28%，α-螺旋6.28%，β-转角32.37%；对pH 1.5,37 ℃处理组，β-折叠53.07%，无规则卷曲8.28%，α-螺旋6.29%，β-转角32.36%；对pH 1.5,55 ℃处理组，无规则卷曲58.06%，β-转角41.94%。由上述分析可知，在25～37 ℃范围内，pH 1.5偏移处理可使α-螺旋向β-折叠、β-转角和无规则卷曲转化，当增至55 ℃时，α-螺旋和β-折叠全部转化为β-转角和无规则卷曲。α-螺旋和β-折叠为BBPI的有序结构，β-转角和无规则卷曲为无序结构，随温度不断增加，BBPI的α-螺旋和β-折叠百分含量之和呈明显降低趋势，这表明BBPI稳定性逐渐降低。

表1 不同pH和温和热处理对BBPI二级结构含量的影响

2.8 电镜扫描

图13～图16分别为BBPI在pH 7.0,25 ℃、pH 1.5,25 ℃，pH 1.5,37 ℃和pH 1.5,55 ℃条件下，处理1.5 h时扫描电镜下的形貌。由图13～图16可知，不同温度处理下，BBPI均形成大小不均匀的球状体，粒径约为80～130 nm。各球状体存在团聚现象，形成“沟壑”，如A、B、C区域所示，随温度增大，团聚现象降低，可能与溶解性增强有关，但球体粒径较为接近。与pH 7.0,25 ℃处理组比较，pH 1.5,25 ℃形貌变化不大，可能是1.5 h处理时间较长，不同程度抵消了pH 1.5处理对BBPI形貌等的影响。

图13 pH 7.0,25 ℃条件下BBPI形貌

Fig.13 Morphology of BBPI at pH 7.0,25 ℃

图14 pH 1.5,25 ℃条件下BBPI形貌

Fig.14 Morphology of BBPI at pH 1.5,25 ℃

图15 pH 7.0,37 ℃条件下BBPI形貌

Fig.15 Morphology of BBPI at pH 7.0,37 ℃

图16 pH 7.0,55 ℃条件下BBPI形貌

Fig.16 Morphology of BBPI at pH 7.0,55 ℃

3 结论

(1)随时间延长，BBPI溶解性和乳化性均先降低后增加，但与pH 7.0,25 ℃处理组相比，各组溶解性均增加，乳化性几乎均下降。乳化性随温度的升高而增强，但溶解性并不完全与温度成正比。随时间延长，乳化稳定性无明显规律，但均随温度增加而逐渐增强，37和55 ℃处理组巯基含量先增加后降低，25 ℃处理组则变化不大，37 ℃处理组总巯基含量先增加后迅速下降，25和55 ℃先平稳后降低。

(2)紫外和荧光光谱表明，随时间延长，25 ℃处理组的大部分色氨酸残基包裹在分子内部疏水微环境，发生1～2 nm红移动，37 ℃处理组表现为色氨酸残基开始部分性解折叠，色氨酸残基又逐渐暴露在分子表面，发生1～2 nm蓝移，55 ℃处理组则未有明显变化。

(3)结果表明，BBPI的表面疏水性与溶解性呈负相关，与乳化性成正相关。25和37 ℃处理时，BBPI的表面疏水性先增加后降低，55 ℃处理则先增加后出现一定波动。

(4)随温度升高，BBPI二级结构中的α-螺旋和β-折叠逐渐转化为β-转角和无规则卷曲。随温度升高，BBPI电镜扫描均形成粒径约为80～130 nm的球状体，且存在团聚和“沟壑”现象，但团聚现象逐渐降低。

(5)由于未变性或完全变性的蛋白具有相对较强的热稳定性，功能特性并不十分理想，而通过pH偏移结合温和热处理改性处理，BBPI构象发生一定程度变化而形成熔球态，则有望进一步改善其起泡性、溶解性、乳化性、成胶性和成膜性等功能性质，这将有助于进一步提高BBPI的应用价值和拓展其应用范围。