重组大肠杆菌全细胞合成D-苯基乳酸

鲍志伟，苏晓，杨柳婷，陈耀，罗希，付永前,孙小龙

(台州学院 生物质资源研究所，浙江 台州，318000)

苯基乳酸(phenyllactic acid, PLA)即2-羟基-3苯基丙酸，分子式为C9H10O3，相对分子质量为166，第2位碳原子为手性碳原子，因此具有2种对映异构体，包括D-和L-苯基乳酸[1]。

图1 D-苯基乳酸(a)和L-苯基乳酸(b)

Fig.1 D-phenyllactic acid (a) and L-phenyllactic acid (b)

苯基乳酸是一种天然有机酸，广泛存在于蜂蜜和乳酸菌发酵品干酪中，对人和动物无毒无害。对酸和热的稳定性好，熔点为121～125 ℃，且亲水性大，能在食品体系中均匀扩散[1]。苯基乳酸有着明显的抑菌作用，抑菌谱广，对大多数微生物均有抑制作用，尤其是多种食源性致病菌[2-5]。苯基乳酸不仅是一种理想的新型食品防腐剂[6]，还在饲料添加剂[7]、医药[8-11]、化妆品[12]等领域有着广泛应用。

有研究表明D型苯基乳酸抑菌效果强于L型苯基乳酸[1]。并且在很多细菌内包括乳酸菌内(例如植物乳杆菌)存在2种乳酸脱氢酶，D-乳酸脱氢酶(D-LDH)和L-乳酸脱氢酶(L-LDH)，其中D-LDH对苯丙酮酸钠(sodium phenylpyruvat, PPA)的比活力是L-LDH比活力的3倍[13]。RODRIGUEZ等[14]以植物乳杆菌CECT-221为生产菌株，以苯丙氨酸为底物生产苯基乳酸，对培养条件进行优化，在2 L的发酵罐中发酵培养158 h，产量由原来的0.23 g/L上升到0.7 g/L。由植物乳杆菌转化苯丙氨酸生产苯基乳酸周期长、产量低、发酵液成分复杂，不利于后续分离纯化；而大肠杆菌代谢路径清晰，培养周期短，因此选择重组大肠杆菌，以苯丙酮酸钠(PPA)为底物，利用全细胞转化合成D-苯基乳酸。

1 材料和方法

1.1 菌种

重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-ldhD，台州学院生物质资源研究所保藏。

1.2 材料与试剂

葡萄糖、NaCl、KH2PO4、K2HPO4购于广东汕头市西陇化工厂；酵母膏、蛋白胨购自英国Oxoid公司；苯基乳酸、苯丙酮酸钠购于阿拉丁试剂公司。

1.3 实验设备与分析仪器

CHA-SA气浴恒温振荡器(上海江星仪器有限公司)；SBA-40C生物传感仪(山东微生物研究所)；BSA224S 电子天平(赛多利斯公司)；高效液相色谱仪(岛津LC-20A)。

1.4 实验方法

1.4.1 重组大肠杆菌的培养及诱导

按1%的接种量接种重组大肠杆菌，LB培养基(酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0，121 ℃，灭菌20 min，250 mL摇瓶分装50 mL)，37 ℃、200 r/min培养至OD600=0.8，加诱导剂IPTG至终浓度1.0 mmol/L，25℃诱导培养2 h；诱导后的菌液4 ℃、6 000 r/min离心10 min，再用生理盐水洗涤2次，最后重悬于转化液(含9 g/L底物PPA、50 mmol/L磷酸缓冲液)中，置于37 ℃、200 r/min摇床中反应2 h后取样，利用高效液相色谱检测苯基乳酸含量。

1.4.2 诱导条件的优化

分别考察不同诱导剂浓度及诱导时间对全细胞转化合成苯基乳酸的影响。重组大肠杆菌基础诱导条件如下：培养至OD600=0.8时，添加IPTG至终浓度为1 mmol/L，25 ℃诱导2 h。

1.4.3 全细胞转化条件的优化

在优化后的最佳诱导条件下，进一步探索并优化全细胞的转化条件。分别考察葡萄糖浓度、温度、菌体量、底物浓度、金属离子、表面活性剂、是否进行超声破碎和有机溶剂处理等因素，对全细胞转化合成苯基乳酸的影响。重组大肠杆菌基础转化条件如下：收集15 g/L菌体(干重)重悬于含9 g/L PPA的转化液中，置于37 200 r/min摇床中，转化2 h。

1.4.4 补料分批添加对转化的影响

在最佳诱导条件下，培养后离心得菌体，取30 g/L菌体重悬于转化液中。转化液中初始底物PPA质量浓度为5 g/L，葡萄糖质量浓度为5 g/L。分别以不同方式分批补加葡萄糖和PPA。

1.5 分析方法

苯丙酮酸钠和D-苯基乳酸的检测：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱；1 mmol/L H2SO4-乙腈(V(H2SO4)∶V(乙腈)=85∶15)，流速0.7 mL/min；检测波长为210 nm；柱温为30 ℃；进样体积20 μL[15]。

葡萄糖浓度的测定采用SBA-40D传感分析仪检测。

菌体干重(DCW)：将培养物抽滤，60 ℃烘干至恒重，称重。

2 结果与分析

2.1 诱导条件的优化

本实验对不同诱导剂浓度和诱导时间的影响进行了考察，由图2-A可知，当IPTG终浓度小于0.2 mmol/L时，苯基乳酸的产量随IPTG浓度的增加而增加，当IPTG终浓度达0.2 mmol/L时，苯基乳酸的产量最高达到3.56 g/L，但随着诱导剂浓度的增加，苯基乳酸产量下降。图2-B可知，随着诱导时间的增加，苯基乳酸产量逐渐上升，苯基乳酸产量在诱导4 h时达到最大；当诱导时间大于4 h后，苯基乳酸的产量开始下降。原因可能是随着诱导剂量的增加、诱导时间的延长，重组大肠杆菌地生长受到了抑制。

图2 不同诱导条件对苯基乳酸转化合成的影响

Fig.2 Effects of different induction conditions on the conversion and synthesis of phenyllactic acid

最终选取诱导剂ITPG的最佳终浓度为0.2 mmol/L，最佳诱导时间为4 h。

2.2 转化条件的优化

2.2.1 转化体系的优化

本实验还分别考察转化体系中葡萄糖浓度、转化温度、菌体量、底物PPA浓度、金属离子及表面活性剂等因素对全细胞转化合成苯基乳酸的影响，结果见图3。由图3-A可知，与未添加葡萄糖相比，添加葡萄糖后的苯基乳酸产量提高了12倍，原因是菌体对葡萄糖的代谢，可以为转化反应提供大量的能量和NADH，使反应可以持续进行。但随着葡萄糖浓度的升高，超过5 g/L时，苯基乳酸产量呈下降趋势。在转化结束时，转化液pH值都有不同程度的下降，推测可能是葡萄糖在代谢中产生了酸性副产物，如乙酸、乳酸等，从而抑制了菌体的活性。因此最终选取的最佳葡萄糖浓度为5 g/L。

由图3-B可知，当转化温度由32 ℃升高至37 ℃时，苯基乳酸的产量也随之提高；当转化温度从37 ℃提高至42 ℃，产量无明显变化。乳酸脱氢酶的最适温度为37 ℃，采用全细胞转化法的优势在于细胞结构对酶具有一定的保护作用，温度的变化使酶不容易失活，故最终选取37 ℃作为最佳转化温度。

由图3-C可知，菌体量对苯基乳酸产量也有一定影响，与初始菌体量(15 g/L)相比，当使用30 g/L菌体量进行转化时，产量有所提升，原因可能是由于菌体的增多从而增加了乳酸脱氢酶的总量，提高了苯基乳酸产量；而当菌体量大于30 g/L时，产量呈现明显下降的趋势，可能是由于菌体继续增加，菌体与底物间接触面积减小，同时增加了葡萄糖的消耗，减少了反应时间，使得苯基乳酸的产量下降。故本实验选取30 g/L菌体量作为最佳菌体量。

由图3-D可知，当底物质量浓度小于13 g/L时，苯基乳酸的产量随着底物质量浓度的增加不断提高，但在底物质量浓度9～13 g/L之间，变化不明显；当底物质量浓度超过13 g/L时，产量开始呈现下降趋势，原因可能是随着底物质量浓度的不断提高，酶的活性部位被抑制，使产量也随之下降。最终选取最佳底物质量浓度为13 g/L。

由图3-E可知，相比较不加金属离子的对照组，添加金属离子Na+、Mg2+、K+对产量有一定的提升，原因是金属离子可以作为酶的激活剂从而提高酶的转化率。实验采用了同1种金属离子1 mmol/L和100 mmol/L 2种浓度进行比较，从图中可知，与1 mmol/L金属离子浓度相比，100 mmol/L金属离子对产量提升效果更加明显。纵向比较3种离子的效果，可以得出Mg2+效果最佳。

由图3-F可知，各类表面活性剂的添加对产量均有一定的提升作用，但需要控制好添加浓度，否则会使菌体破裂，使酶活下降，导致产量大幅度降低，如0.1%的Triton X-100会使产量大幅度降低。实验结果可知PEG-200、PEG-400和吐温-80都可添加至转化液中提高产量。

最终选取最佳转化条件：5 g/L葡萄糖，13 g/L PPA，转化温度为37 ℃，30 g/L菌体量。单批次苯基乳酸最大产量可达5.2 g/L，产率为40%。

图3 不同全细胞转化体系对苯基乳酸合成的影响

Fig.3 Effects of different whole cell transformation systems on the synthesis of phenyllactic acid

2.2.2 菌体处理对合成苯基乳酸的影响

本实验采用超声功率为120 w，超声3 s、停3 s的破碎方法，对菌体进行超声处理，结果见图4，随着超声破碎的时间延长，产量大幅下降，可能是因为超声致使菌体的破裂，胞内NADH无法再生，并且在超声过程中会产生大量的热量，酶易变性失活，使得反应终止，产量下降。由图4-B可知，菌体经10%浓度乙醇浸泡后，产量比原来提高了约15%。菌体经1%丙酮浸泡后，产量提升了22.6%，而经10%丙酮浸泡后，产量下降29.2%，低浓度乙醇和丙酮等有机溶剂可以提高细胞膜的通透性，增加了底物在胞内的浓度，提高了酶与底物的接触几率。但高浓度的有机溶剂易使大肠杆菌细胞溶解，造成NADH无法再生，并可能使酶变性失活，造成反应无法正常进行，苯基乳酸的产量降低。初步判断大肠杆菌菌体经1%丙酮浸泡处理后，具有较好提高苯基乳酸产量的作用。

图4 不同菌体处理方式对苯基乳酸合成的影响

Fig.4 Effects of different bacteria treatments on the synthesis of phenyllactic acid

2.2.3 补料分批添加对产量的影响

对底物和葡萄糖分批添加底物的初步探索，底物PPA按图5中所示3种方式添加，对比3种底物添加方式，图5-A中方式最好，通过表1数据可知，补料添加后产率提高至52.7%，产量为7.38 g/L. 分批添加底物与葡萄糖，可不断提供能量和还原型辅酶NADH，有效解除高浓度底物的抑制，提高产量和产率。

A-每隔20 min，固定补加3 g/L PPA，共补加3次；B-每隔20 min，PPA补加至5 g/L，共补加3次；C-每隔30 min，PPA补加至5 g/L，共补加2次

图5 底物(PPA)与葡萄糖分批添加方式对苯基乳酸合成的影响

Fig.5 Effects of substrate and glucose batch addition on the synthesis of phenyllactic acid

表1 苯基乳酸产量对比

Table 1 Comparison of phenyllactic acid Production

文献报道产率[11]优化前优化后单批发酵补料发酵PLA产量/(g·L-1)0.70.255.27.38生产率/%/2.7840.052.7

3 结论

通过一系列实验，本文探索并优化了重组大肠杆菌全细胞转化合成D-苯基乳酸的条件，最终确定了最佳诱导及转化条件。同时以苯丙酮酸钠作为底物，在最佳条件下，苯基乳酸产量达到7.38 g/L，产率为52.7%，与优化前相比，产量提高了近30倍。通过添加不同金属离子、表面活性剂及菌体有机溶剂处理的研究，发现这些因素对产量都有不同程度的提高。并且底物分批添加的方式能有效解除高浓度底物的抑制，从而有效提高苯基乳酸的产量和产率，为进一步提高苯基乳酸的全细胞转化合成苯基乳酸的产量和产率奠定了基础。

在苯丙酮酸钠转化为苯基乳酸的酶促反应中，伴随着NADH的消耗，有文献报道辅酶再生系统的构建，即通过将2个酶反应偶联使得NADH再生，实现胞内NAD+/NADH的循环，对产率提高具有明显作用[15]。可以看出重组大肠杆菌全细胞转化合成D-苯基乳酸的产率仍有较大提升空间，具有广阔的前景。