植物乳杆菌P-8羟基脂肪酸脱氢酶的克隆表达及活性鉴定

赵彤彤，赵微，王丹，赵国芬*，刘扬，张和平，包秋华

1(内蒙古农业大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特，010018) 2(内蒙古农业大学，乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特，010018)

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是多种含有共轭双键十八碳二烯酸的总称，它具有多种营养和保健功能，如抗癌、抗动脉粥样化和延缓机体免疫力衰退、减肥等[1-3]。目前合成CLA的方法主要有化学法和生物法2种。化学法合成的CLA产品中各种异构体形式并存，而且产品还存在溶剂残留问题[4]。生物法转化CLA产物中具有生理活性的异构体形式含量较高，产品安全性较高。目前研究表明，一些瘤胃微生物、丙酸杆菌、乳酸菌和双歧杆菌能够将亚油酸(linoleic acid，LA)转化为CLA[5]。相比于严格厌氧且生长较慢而难以用于大规模生产的瘤胃菌、具有致病性的痤疮丙酸杆菌，乳酸菌具有易大规模培养、食品级微生物等优点，所以利用乳酸菌转化CLA已经是当前的研究热点[6-7]。

研究表明，大部分乳酸菌将LA转化为CLA的通路是先将LA水合为10-羟基-顺 12-十八碳烯酸(10-hydroxy-cis 12-octadecenoic acid,10-HOE)，后经脱氢、双键移位、水合、脱水等多步反应而转化为CLA，需要脂肪酸水合酶(fatty acid hydratase,CLA-HY)、羟基脂肪酸脱氢酶(hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH)与乙酰乙酸脱羧酶(fatty acid isomerase,CLA-DC)组成的亚油酸异构酶系共同参与代谢过程[8]。CLA-DH在亚油酸在乳酸菌的代谢中起着重要的作用，可以将10-HOE转化为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸。很多羟基脂肪酸都可以作为良好底物被转换为相应的氧代脂肪酸[9]，并且很多氧代脂肪酸也被发现有独特的生理功能，例如10-氧代-顺-12-十八碳烯酸激活过氧化物酶体增生激活受体(peroxisome proliferative activated receptor, PPARg)诱导脂肪细胞分化，13-氧代-9,11-十八碳二烯酸可以改善肥胖症引起的血脂异常和肝脂肪变性等[10]。

图1 部分乳酸菌中LA转化为CLA的过程

Fig.1 The process of LA conversion to CLA inLactobacillus plantarum

内蒙古是乳制品生产研发大省，植物乳杆菌P-8是源自内蒙古乌拉特中旗的优良发酵菌种，经研究表明该菌具有产生CLA的能力，但产量较小且具体机制尚不清楚[11]。本研究对植物乳杆菌P-8中的羟基脂肪酸脱氢酶基因进行了克隆和生物信息学分析，并将其在大肠杆菌中表达，经诱导表达后得到有活性的重组酶CLA-DH。为进一步研究植物乳杆菌P-8中羟基脂肪酸脱氢酶的性质和功能提供了必要条件，为提高植物乳杆菌P-8转化CLA的产量并将其应用于食品、保健品奠定了重要理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和载体质粒

本实验所用植物乳杆菌P-8和pET-28a(+) Vector由本实验室保藏，大肠杆菌E.coliDH5α Chemically Competent Cell购自北京天根生化科技有限公司，大肠杆菌E.coliTransetta (DE3) Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 酶和试剂

本实验所用限制性内切酶EcoRⅠ、限制性内切酶XhoⅠ、T4连接酶均购自于北京全式金生物技术有限公司；高保真DNA聚合酶KOD plus购自Toyobo公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；亚油酸购自Sigma公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

利用Primer 5.0软件，根据NCBI中已知的植物乳杆菌P-8的CLA-DH序列以及pET-28a(+)载体的多克隆位点，设计了1对特异性引物(表1)，由华大基因完成。

表1 引物序列

注：划线部分为引入的酶切位点。

1.2.2CLA-DH基因的扩增与序列分析

以植物乳杆菌P-8基因组为模板用高保真KOD plus酶进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，50℃退火40 s，68℃延伸1 min，30个循环；68℃保温10 min。产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，并将目的条带切胶后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，送往华大基因进行测序。测序结果使用Blast进行确认，使用DNAstar翻译成氨基酸序列进行分析。使用Proparam对序列进行蛋白质理化性质的预测分析，使用Protscal进行蛋白质亲疏水性预测分析，使用TMHMM进行跨膜区预测分析，使用Net Phos3.1 Server进行磷酸化位点分析，使用PSLpred进行亚细胞定位分析，使用SOPMA和Predict Protein进行二级结构分析。

1.2.3 重组菌的构建

将纯化后的PCR产物和pET-28a(+)质粒分别通过EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，切胶回收后16 ℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌E.coliDH5α，涂布含50 μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选。挑取转化子，扩大培养后提取质粒，经菌液PCR和质粒双酶切验证后,获得重组质粒pET-28a-DH。将重组质粒pET-28a-DH转化至大肠杆菌E.coliTransetta (DE3)，同时转化pET-28a(+)空质粒作为阴性对照，获得重组菌E.coliTransetta/pET-28a-DH和对照菌E.coliTransetta/pET-28a。

1.2.4 重组酶的诱导表达

挑取重组菌E.coliTransetta/pET-28a-DH和对照菌E.coliTransetta/pET-28a单菌落分别接种于20 mL LB培养基(含有50 μg/mL卡那霉素和150 μg/mL氯霉素)中37 ℃、180 r/min培养过夜，按2%接种量转接入1 L LB培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养至OD600为0.6，加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L，16 ℃、130 r/min诱导培养16 h。离心收集菌体并重悬于KPB缓冲液(20 mmol/L，pH值6.5)中，在冰浴中进行超声破碎，12 000 r/min离心1 h，得上清和沉淀。通过12% SDS-PAGE进行分离后，转至NC膜上，加入封闭液封闭过夜。然后用一抗(1∶2000稀释)、二抗(1∶1000稀释)先后孵育结合1 h，通过DAB显色法进行显色反应。

1.2.5 纯化重组酶

利用pET-28a(+)质粒中的his-tag标签，使用镍柱对重组酶进行纯化。将离心得到的上清加入到镍柱中，用含有不同浓度咪唑的缓冲液进行洗脱，分别收集洗脱液进行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重组酶活性检测

实验室之前已成功构建有活性的植物乳杆菌P-8的脂肪酸水合酶工程菌E.coliBL21/pET-28a-HY，实验证明其能够将LA水合为10-HOE。收取1.2.4中的离心上清液作为粗制酶液进行活性检测，反应体系为1 mL，其中包含4 μg亚油酸、2 μg吐温80、0.1 mmol/L FAD、5 mmol/L NADH、200 μL CLA-HY粗酶液、200 μL CLA-DH粗酶液，KPB缓冲液补至1 mL。对照组包含4 μg亚油酸、2 μg吐温80、0.1 mmol/L FAD、5 mmol/L NADH、200 μL CLA-HY粗酶液、200 μL pET-28a(+)空质粒粗酶液，KPB缓冲液补至1 mL。反应在37 ℃、120 r/min的条件下进行6 h后，加入5 mL正己烷充分振荡30 s，3 000×g离心5 min，吸取上层正己烷至干净试管中用N2吹干，加入2 mL 4%盐酸-甲醇溶液50 ℃水浴20 min进行甲酯化，再次萃取脂肪酸后用N2吹干，加入100 μL正己烷回溶，使用GC-MS检测分析。GC-MS条件: Finnigan Trance GC /FinniganTrance MS (美国Thermo)，色谱柱: Agilent DB-WAX(30 m×0.250 mm×0.25 μm)。升温程序: 40 ℃保持0.5 min后以20℃/min的速度升至280 ℃，保持10 min。

2 结果与分析

2.1 CLA-DH基因的扩增

在NCBI中查找到植物乳杆菌P-8的CLA-DH序列，全长861 bp。以植物乳杆菌P-8基因组为模板，PCR扩增短链脱氢酶CLA-DH基因，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到约860 bp大小的片段(图2)，与预期的理论值大小相同。将PCR产物胶回收后，送往华大基因测序，测序结果使用Blast验证，结果显示得到正确的植物乳杆菌P-8中CLA-DH。

M-DNA Marker; 1-CLA-DH PCR产物

图2 CLA-DH基因PCR产物电泳图

Fig.2 Electrophoresis gram of PCR product of CLA-DH

2.2 CLA-DH的生物信息学分析

经序列分析表明，CLA-DH基因序列共编码286个氨基酸(图3)，其中极性氨基酸127个，非极性氨基酸132个，编码蛋白的理论分子质量为32.091 8 kDa，理论等电点为5.15。不稳定指数为25.53，属于稳定蛋白，脂肪系数为85.48。

对CLA-DH进行磷酸化位点分析，结果表明存在3个Ser磷酸化位点、3个Thr磷酸化位点和7个Tyr磷酸化位点。对CLA-DH进行疏水性分析，结果表明第142位的丙氨酸疏水性最强，第201位的组氨酸亲水性最强，总平均亲水系数为-0.179，所以CLA-DH是1个亲水性蛋白。对CLA-DH进行跨膜区分析，结果表明CLA-DH不含跨膜区。对其进行细胞定位预测，结果显示CLA-DH为细胞质蛋白。对CLA-DH二级结构进行预测，发现其二级结构主要为40%左右的α-螺旋、30%左右的无规则卷曲和20%左右的β-折叠。

图3 CLA-DH的氨基酸序列

Fig.3 Amino acid sequence of CLA-DH

2.3 重组质粒的构建

将纯化后的CLA-DH基因和pET-28a(+)质粒分别经EcoRⅠ和XholI双酶切后回收酶切产物，连接后转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，挑取转化子进行培养后提取质粒进行双酶切验证，获得大小分别为5 300 bp和860 bp的片段(图4)，与理论值相符。为进一步验证阳性克隆，将酶切验证正确的质粒测序，结果显示已经插入正确的目的基因，将重组质粒保藏并命名为pET-28a-DH。

M-DNA marker；1-双酶切产物

图4 重组质粒pET-28a-DH双酶切鉴定电泳图

Fig.4 Electrophoresis gram of recombined plasmid pET-28a-DH by two enzymes digestion

2.4 重组菌的构建与诱导表达

将pET-28a-DH和pET-28a(+)空质粒转化至E.coliTransetta (DE3)感受态细胞中，获得重组菌E.coliTransetta/pET-28a-DH和对照菌E.coliTransetta/pET-28a。将诱导表达后菌体用KPB缓冲液洗涤2遍。超声破碎离心后收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析和Western Blot分析。结果显示与对照菌相比，重组菌E.coliTransetta/pET-28a-DH在上清部分约38 kDa处有1条明显的目标蛋白条带(图5)，与预测目标蛋白大小基本一致，表明获得CLA-DH的可溶性表达，Western Blot结果也再次验证目标蛋白成功表达。

A-诱导表达后重组菌株蛋白的SDS-PAGE；B-Western Blot检测;M-蛋白Marker；1-阴性对照全细胞；2-上清；3-沉淀

图5 诱导表达后重组菌株蛋白的SDS-PAGE和Western Blot检测

Fig.5 SDS-PAGE analysis of the proteins from recombinants induction

2.5 重组酶的纯化

粗酶液与镍柱亲和后，分别用20、40、60、80、100、200 mmol/L咪唑洗脱液进行梯度洗脱，将洗脱液进行SDS-PAGE分析，结果显示200 mmol/L咪唑洗脱液中得到大量单一的目的蛋白(图6)。

M-蛋白Marker；1-破碎上清液；2-20 mmol/L咪唑洗脱液；3-40 mmol/L咪唑洗脱液；4-60 mmol/L咪唑洗脱液；5-80 mmol/L咪唑洗脱液；6-100 mmol/L咪唑洗脱液；7-200 mmol/L咪唑洗脱液

图6 镍柱纯化重组酶的SDS-PAGE分析

Fig.6 SDS-PAGE analysis of purification of recombinant enzymes by Ni-NTA affinity chromatography

2.6 重组酶活性检测

实验室前期已成功构建的工程菌亚油酸水合酶大肠杆菌工程菌E.coliBL21/pET-28a-HY。亚油酸标准品经GC检测在12.12 min出峰，加入CLA-HY粗酶液与亚油酸反应后经GC-MS检测在14.8 min出现新的产物峰，经MS碎片结果及理论断裂方式分析确定为10-HOE。同时加入CLA-HY和CLA-DH粗酶液进行反应后，经GC-MS检测在14.11 min出现新的产物峰(图7)，结合MS结果及理论断裂方式(图8)分析该物质为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸，证明CLA-DH能够将10-HOE转化为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸。

图7 E.coli BL21/pET-28a-HY和E.coli BL21/pET-28a-DH共同反应LA的GC结果

Fig.7 GC results of LA co-reacting with E.coli BL21/pET-28a-HY and E.coli BL21/pET-28a-DH

图8 产物的MS碎片结果及理论断裂方式

Fig.8 MS fragmentation results of the product and theoretical fracture mode

3 讨论

植物乳杆菌转化LA生成CLA需要CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC组成的亚油酸异构酶系共同参与代谢过程。植物乳杆菌P8可以转化LA生成CLA，而且基因组中也存在这3种酶，但其转化CLA能力较弱，说明可能是3种酶性质不同造成转化能力不同。CLA-DH分别催化具有内部羟基或氧代基团的脂肪酸的脱氢和氢化，是植物乳杆菌生物转化CLA过程中的关键步骤。有研究表明CLA-DH属于短链脱氢酶/还原酶(SDR)家族，与其他SDRs有很大的相似性，但关于SDR家族中的羟基脂肪酸脱氢酶报道很少[8]。研究CLA-DH的酶学性质有助于探明植物乳杆菌P-8转化CLA能力较弱的原因，所以本实验克隆得到植物乳杆菌P-8中的CLA-DH基因，对其进行了生物信息学分析，并构建了CLA-DH的重组大肠杆菌，通过诱导表达得到有活性的CLA-DH重组酶，为深入研究CLA-DH的酶学性质提供了实验基础，而且为进一步提高CLA产量并将其广泛应用于食品、药品、保健品中奠定了理论基础。