脂质氢过氧化物氧化对核桃分离蛋白结构的影响

王丹丹，孙领鸽，毛晓英

(石河子大学食品学院，新疆 石河子，832000)

脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)广泛存在于动植物体内，它可以通过分子内加氧的方式催化多不饱和脂肪酸氧化产生脂质氢过氧化衍生物[1]，脂质氢过氧化衍生物能够攻击食品中的蛋白质组分，引起蛋白质发生氧化，降低食品品质[2-3]。蛋白质氧化使得蛋白主链发生断裂、氨基酸残基侧链发生改变以及形成蛋白质交联物[4]。目前研究发现，LOX催化多不饱和脂肪酸发生氧化，产生具有破坏活性的自由基，使得蛋白质之间相互作用，最终形成聚集体[5-6]；LOX诱导的脂质过氧化反应导致蛋白质的风味和某些功能性质发生不期望的变化[7-8]；HUANG的研究结果也表明，LOX催化亚油酸的产物能够改变大豆蛋白的结构[9]。

核桃仁含有丰富的脂肪和蛋白质，桃仁油中不饱和脂肪酸含量很高，占总脂肪含量的 88.54%，其中不饱和脂肪酸中亚油酸含量为30.43%[10]。核桃中含有的不饱和脂肪酸极易氧化酸败，从而诱导核桃蛋白发生氧化变质，最终影响核桃蛋白产品的色泽、风味及品质，降低核桃蛋白产品的商品价值[11]。核桃氧化酸败根本原因是脂质发生自动氧化，产生过氧化物，从而氧化变质[12]。目前，LOX在核桃蛋白氧化酸败中的作用及其调控机理还不清楚，因此本研究以脂肪氧合酶、亚油酸和核桃分离蛋白构建模拟氧化体系，研究脂肪氧合酶催化亚油酸氧化对核桃分离蛋白结构特性的影响。

本研究以LOX催化亚油酸产生的脂质氢过氧化物(hydrogen peroxide lipid content, HPODE)对核桃分离蛋白进行不同程度的氧化，通过测定核桃蛋白样品的溶解度、羰基含量、表面疏水性、圆二结构、内源荧光、相对分子质量分布等指标，研究脂质氢过氧化物所诱导的蛋白质氧化对蛋白质结构及理化特性的影响，探究核桃蛋白中脂质与蛋白质相互作用的机理，从而为核桃蛋白加工过程提高蛋白产品的质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆薄皮核桃：石河子市农贸市场；脂肪氧合酶(LOX I-B)(98 005 units/mg)：东京化成工业株式会社；亚油酸：色谱纯；2,4-二硝基苯肼，1-苯氨基萘-8-磺酸等分析试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LGJ-18S 冷冻干燥机，北京松源华兴科技有限公司；PHS-3C雷磁pH计，上海精科仪；台式高速冷冻离心机，力康发展有限公司；HH-42快速恒温数显水箱，上海精宏试验设备有限公司；F-7000荧光光谱仪，日本日立公司；MOS-450圆二色光谱仪，法国Biologic公司。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃分离蛋白的制备

参照毛晓英的方法[13]，以新产薄皮核桃为原料，碱液浸泡核桃仁，手动去皮、粉碎，正己烷脱脂后得到核桃蛋白脱脂粉。核桃蛋白脱脂粉用乙醇醇洗，将醇洗后的残渣用去离子水溶解，经碱溶酸沉法制备核桃分离蛋白。收集沉淀，用去离子水调节沉淀pH 7.0，最后冷冻干燥得到核桃分离蛋白粉末(walnut protein isolate, WPI)，装瓶置于4 ℃保存备用。

1.3.2 氧化核桃蛋白的制备

亚油酸溶液、酶液的制备以及模拟反应的建立参照叶林的方法[14]。

1.3.3 WPI溶解度的测定

取0.05 g核桃蛋白样品溶于10 mL去离子水中，室温下磁力搅拌2 h，5 000 r/min离心30 min，取上清液，釆用微量凯氏定氮法测定其蛋白含量。

(1)

式中：P为可溶蛋白的量；W为样品蛋白的量。

1.3.4 WPI羰基含量的测定

参照HUANG等的方法[15]进行测定，采用2,4-二硝基苯肼在367 nm处进行比色。

1.3.5 WPI游离巯基含量的测定

参照HUANG的方法[15]，采用DNTB比色法。

1.3.6 表面疏水性的测定

采用ANS荧光探针法。称取0.05 g核桃蛋白样品溶于10 mL 0.01 mol/L(pH 8.0)磷酸盐缓冲液，采用BCA法测定离心后上清液中蛋白浓度。用0.01 mol/L(pH 8.0)磷酸盐缓冲液稀释核桃蛋白质量浓度在 0.005～0.5 mg/mL之间，加入50 μL 8 mmol/L ANS溶液，激发波长为395 nm，发射波长为473 nm。以蛋白质质量浓度为X轴，荧光强度值为Y轴，得到的斜率即为蛋白质表面疏水性指数。

1.3.7 WPI二级结构的测定

将0.05 g核桃分离蛋白分散于10 mL去离子水中，以双缩脲法测定离心(8 000×g，30 min)后上清液中的蛋白质量浓度，并通过稀释使得上清液中核桃蛋白质量浓度为 50 μg/mL。采用MOS-450 圆二色光谱仪测定190～250 nm之间的远紫外CD光谱，最后以平均摩尔椭圆率[θ](deg cm2/dmol)表示。

1.3.8 WPI内源荧光测定

称取0.05 g核桃蛋白样品溶解于10 mL 0.01 mol/L (pH 8.0) 磷酸盐缓冲溶液中，以双缩脲法测定离心(8 000×g，30 min)后上清液的蛋白质量浓度，并通过稀释使其质量浓度达到 0.1 mg/mL。采用荧光分光光度计以290 nm处为激发波长，扫描300～400 nm处的发散光谱，测定氧化WPI样品的荧光光谱。其两者的狭缝宽设置均为5 nm。

1.3.9 WPI相对分子量分布的测定

根据HUANG的方法[15]略改。将WPI样品用去离子水配制为1 mg/mL的溶液，采用Water 2690型液相色谱系统检测。

1.4 数据统计及分析

所有数据均测定3次，数据表示为平均值±标准差SD。采用SPSS 23.0对数据进行显著性分析，使用Origin 8.5对数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 WPI溶解度的分析

蛋白质的溶解度是蛋白质与水之间相互作用的综合结果，蛋白质的氨基酸组成，亲/疏水性，所带电荷等内部因素都会影响蛋白质的溶解度[16]。LOX催化亚油酸氧化对核桃蛋白溶解度的影响如表1所示。

表1 亚油酸不同添加量制备核桃蛋白溶解度、羰基、游离巯基和表面疏水性

注：样品各指标为3次测定值的平均；数值表示为均值±标准误差；同一列中的不同字母表示在P<0.05 水平上有显著差异。

随着亚油酸添加量的增加，核桃蛋白溶解度从8.94%下降到6.89%。但是亚油酸添加量≤4.5 mL时，核桃蛋白溶解度变化不显著；亚油酸添加量≥7.5 mL，核桃蛋白溶解度显著性下降(P<0.05)。核桃蛋白样品溶解度下降是因为低浓度的氢过氧化物氧化使得核桃蛋白形成了可溶性聚集体，而高浓度的氢过氧化物氧化导致的共价交联使得产生的可溶性聚集体进一步发生聚集形成不可溶性聚集体[17]。孙领鸽等[18]指出，丙烯醛氧化浓度逐渐增加，核桃蛋白溶解度显著性下降。吴伟等[19]在研究过氧自由基氧化大米蛋白时发现，大米蛋白共价交联形成不可溶性聚集体，使得大米蛋白溶解性降低。蛋白质与脂质氢过氧化物相结合之后，使得蛋白质的能态发生变化，引起蛋白质变性是导致蛋白质溶解度降低的内在原因。

2.2 WPI羰基含量的分析

蛋白质羰基含量是目前用于表征蛋白质氧化程度最为广泛的指标。当亚油酸添加量为4.5 mL时，氧化核桃分离蛋白羰基从2.32 nmol/mg显著增加到3.14 nmol/mg (P<0.05)，亚油酸添加量为9 mL时，蛋白质羰基值达到最高水平(4.23 nmol/mg)(表1)。ZIRLIN[20]研究了亚油酸甲酯对明胶的氧化，蛋白质和脂质反应产生的自由基作用，可以形成蛋白质自由基，蛋白质自由基容易被氧分子袭击，导致蛋白质过氧化，而蛋白质羰基含量增加主要是由于α-碳原子或者侧链氨基酸残基的其他碳原子形成了蛋白质过氧化物。黄友如[21]在研究脂肪氧合酶催化亚油酸诱导大豆蛋白时发现，LOX -大豆分离蛋白、亚油酸-大豆分离蛋白氧化体系中，羰基含量无变化，LOX-亚油酸-大豆分离蛋白模拟体系中，羰基含量在反应1.0 h时明显增加，这说明同时添加LOX和亚油酸致使大豆分离蛋白氧化。ZAMORA等[22]的研究发现，脂质氢过氧化物与蛋白质的氨基酸残基反应后，导致蛋白质的羰基含量增加。以上结果显示，脂质氢过氧化物氧化使核桃蛋白羰基含量增加，核桃蛋白的构象发生改变。

2.3 WPI巯基含量的分析

巯基氧化可以转换形成二硫键，二硫键的形成引起蛋白质分子间发生交叉、联结和聚合，进而导致蛋白空间结构发生变化[16,23]。不同添加量亚油酸对核桃分离蛋白游离巯基结果如表1所示，核桃分离蛋白游离巯基含量随着亚油酸添加量的增加发生显著下降，其分别从未氧化的巯基值2.82 μmol SH/g下降到1.92 μmol SH/g (P<0.05)。巯基含量的降低在一定程度上反映蛋白质的变性，可能是多肽形成分子间分子内二硫键，也可能是因为发生氧化形成其他氧化产物[21]。OBATA研究大豆豆浆时发现，大豆豆浆中巯基基团含量降低，可能与LOX氧化大豆蛋白密切相关[24]。GARDNER研究半胱氨酸和脂质过氧化氢反应时发现，HPODE可与蛋白质中半胱氨酸残基形成稳定的加合物[25]，从而使得蛋白质中游离巯基含量下降。本实验结果表明，较高的亚油酸添加量，核桃分离蛋白发生较充分的氧化作用，致使分子内部的游离巯基群含量下降。

2.4 WPI表面疏水性的分析

表面疏水性(H0)可以反映蛋白质分子与外界极性水环境相连的表面疏水性基团数量[26]，也可以用它来衡量蛋白质的变性程度，它能够观察出蛋白位点在化学上或物理上的微妙变化，所以可以作为评价蛋白变性的一个重要参数[16]。通常用ANS荧光探针法测量H0的变化，用于监测暴露在蛋白质表面的疏水位点，表征蛋白质的变性程度[27]。不同添加量亚油酸对核桃分离蛋白H0的影响如表1所示，亚油酸添加量从0 mL增加到9 mL时，核桃分离蛋白H0从429.66显著下降到405.24 (P<0.05)，这意味着LOX催化亚油酸氧化体系诱使核桃蛋白表面呈现出亲水性。H0下降的原因,一方面是由于氧化造成蛋白质分子去折叠，使得蛋白质内部的疏水集团外露，这些疏水基团再通过疏水作用形成了聚集体；另一方面，氧化形成的蛋白质共价交联使得聚集反应进一步发展，从而形成抗蛋白酶水解的聚集体。H0下降表明氧化后的核桃蛋白构象发生改变。

2.5 WPI二级结构的分析

蛋白质中二硫键、芳香氨基酸残基等具有光学性质，这些具有光活性的基团能够产生偏振光[28]，在250 nm以下的远紫外区的圆二色光谱(circular dichroism, CD)下，蛋白质溶液圆二色性的改变可以反映核桃蛋白二级结构的特征分布[29]。核桃蛋白样品的CD图谱见图1和表2。

图1 HPODE氧化核桃蛋白样品的圆二CD图谱

Fig.1 Circular dichroism spectra of walnut protein samples注：图例中为亚油酸添加量，下同。

亚油酸添加量为0 mL时，WPI圆二色光谱图在192 nm处有一个正峰，说明天然的核桃蛋白具有α-螺旋结构，200 nm处有一个较强的正谱带，此处较接近β-转角的谱带，220～230 nm处出现微弱的正峰，此处可以表征蛋白质中存在无规则卷曲。在亚油酸添加量达到9 mL时，在192 nm处无正峰，200 nm处出现较强的负峰间，这一结果与吴伟等[30]研究蛋白质氧化对大米蛋白二级结构含量时的结果一致。说明脂质氢过氧化物氧化修饰使得核桃蛋白α-螺旋结构减少，无规则卷曲含量升高。叶林曾报道[31]，花生分离蛋白氢键和疏水性作用的改变是由于其二级结构变化而引起的，进而形成蛋白聚集体。

2.6 WPI内源荧光的分析

含有芳香族氨基酸残基如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)残基的蛋白质在一定激发波长照射下会产生荧光，称为内源荧光[32]。来源于紫外照射、衰老和暴露在过氧自由基氧化系统的二聚酪氨酸的结构可在320～360 nm的激发波长下展现荧光特性[33]。GIULIVI表明，暴露在脂质环境中的蛋白质，可以改变氨基酸的序列和蛋白质的组成结构，这些与荧光蛋白质交联有关[34]。YE[35]研究花生蛋白氧化对结构影响时发现，花生蛋白荧光强度随着氧化程度增加而下降且最大荧光峰位蓝移，认为是氧化导致蛋白聚集体形成，色氨酸转移到内部的非极性环境中。关于脂质氢过氧化物氧化核桃分离蛋白内源荧光的影响见图2，结果表明，随着亚油酸添加量的增加，核桃分离蛋白内源荧光强度逐渐下降，从1 009下降到840，而当亚油酸添加量为0～7.5 mL时，其最大荧光峰红移，从330 nm移动到335 nm。荧光峰位红移可以说明荧光发射基团暴露于极性环境下，如溶剂(水)[36]，这与蛋白质表面疏水性下降结果一致。上述结果说明，LOX催化亚油酸产生的氢过氧化物氧化能使色氨酸的微环境变得亲水。进而可以得出，氧化可以导致核桃蛋白的构象发生变化。

图2 HPODE氧化核桃分离蛋白内源荧光的影响

Fig.2 Effect of oxidation modification by HPODE on the intrinsic fluorescence of walnut protein

2.7 WPI相对分子量分布的分析

脂质氢过氧化物氧化对核桃分离蛋白分子量分布的影响如表2所示，核桃蛋白分子量分布图中大部分都出现4个峰，保留时间依次为 5.87、12.3、 13.0和14.4 min，其中保留时间 5.87 min峰对应蛋白质聚集体，保留时间 12.3 min和13.0 min峰对应核桃蛋白和亚基，保留时间 14.4 min峰对应核桃蛋白中天然存在的小肽。随着亚油酸添加量的增加，氧化程度逐渐加大，核桃蛋白保留时间5.87 min峰面积比例持续增加，表明核桃蛋白氧化形成聚集体。当亚油酸添加量增加时，其相对分子质量逐渐变大。根据保留时间和相对分子质量对应标准曲线(y=-1.443x+25.74)得出，亚油酸添加量达到9 mL，其相对分子质量为6.9 kDa(38.65%)、8.1 kDa(32.54%)，而4.96 kDa的小分子多肽几乎检测不到。从结果可以看出，亚油酸添加量增大，氢过氧化物氧化程度增加，诱导WPI形成小的聚集体，聚集体进一步聚集，形成较大的颗粒聚集体。黄友如在研究LOX催化亚油酸氧化对大豆蛋白影响时也证实，LOX催化亚油酸氧化反应时间越长，大豆蛋白的聚集程度越大[21]。此结论与上文阐述的二级结构变化相吻合。

表2 脂质氢过氧化物氧化核桃分离蛋白分子量分布

3 结论

本实验以核桃分离蛋白为研究对象，建立LOX-亚油酸-核桃分离蛋白氧化模型，研究脂质氢过氧化物氧化对核桃分离蛋白结构的影响，研究结果表明：(1)脂质氢过氧化物氧化可以促进蛋白质氧化反应的发生，蛋白质的氧化程度随着亚油酸添加量的增加而增加；(2)随着核桃蛋白氧化程度的增加，蛋白质的表面疏水性和内源荧光都发生显著的变化，蛋白质表面疏水性逐渐减小，最大荧光峰位红移且荧光强度下降；(3)脂质氢过氧化物氧化使核桃蛋白的二级结构发生变化，有序的α-螺旋和β-折叠含量下降的同时无序的β-转角和无规卷曲含量增加，蛋白质稳定的二级结构遭到破坏；(4)脂质氢过氧化物氧化，致使蛋白质小分子多肽含量减少，转化成氧化聚集体。本研究结果表明，脂质氢过氧化物氧化对核桃分离蛋白的结构产生了一定的影响，由于蛋白质的结构决定其功能性，因此，氧化对蛋白结构产生的影响会进一步影响蛋白的功能。在核桃蛋白的加工及贮藏过程中了解其发生蛋白质氧化的程度，对提高核桃蛋白产品的品质和应用具有重要的理论和实践意义。