乳酸杆菌抗肿瘤作用的研究进展

李慧臻,李柏良,李子叶,占 萌,陆婧婧,霍贵成

(东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

乳酸杆菌(Lactobacillus)是不产生芽孢的革兰氏阳性菌,具有耐酸性,通常最适的pH是5.5～6.2,最适的生长温度是30～40 ℃。乳酸杆菌的细胞形状有很多,包括长状、细长状、弯曲状、短杆状和棒形球杆状,一般会形成链[1]。从哺乳动物消化系统和泌尿生殖系统中,分离得到了大量的乳酸杆菌,主要包括植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)、詹氏乳酸杆菌(Lactobacillusjensenii)、短乳酸杆菌(Lactobacillusbrevis)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactis)和干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei)等[2]。大量的乳酸杆菌不仅有调整人体内微生态平衡[3]、降胆固醇[4]和降血糖[5]等功能,还有防止有害微生物的侵袭和抑制肿瘤的发生及生长等作用[6]。

癌症是当下危害人类健康且导致人类死亡的最常见的疾病之一,是人类第二大死亡原因,2015年就造成了880万人的死亡[7]。随着我国人们生活节奏的加快以及社会压力的增大,人们的作息时间和饮食习惯越来越不规律,从而造成了我国癌症的发病率和死亡率愈来愈高。有研究显示,我国2000年至2011年间诊断出的肿瘤患者数量明显增加,并且2010年肿瘤患者死亡人数占总体死亡人数的23.82%[7]。目前,肿瘤治疗主要采用手术、放疗和化疗等综合性治疗手段,主要目的是暂时减轻病人的痛苦,延长患者的生存期,但是化疗药物具有很大的毒副作用,可使患者产生恶心呕吐、口干舌燥、食欲不振、白细胞减少和毛发脱落等现象,治疗效果不佳。乳酸杆菌在全球范围内被认为是GRAS(generally regarded as safe)等级的食品微生物,具有无毒、无污染、无致癌性以及无致病性等优点,作为胃肠道和生殖道的益生菌,不但能够产生抗肿瘤活性的代谢产物,抑制致癌物质的生成,而且还可以激活机体的体液免疫系统和细胞免疫系统,使机体产生肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)和白细胞介素(IL)等细胞因子,诱导肿瘤细胞凋亡,从而增强机体的抗肿瘤免疫反应。因此,深入研究乳酸杆菌在预防和治疗肿瘤方面的作用具有极其重要的意义,本文主要综述了乳酸杆菌对多种肿瘤的抑制作用以及乳酸杆菌的抗肿瘤作用机制。

1 乳酸杆菌对多种肿瘤的抑制作用

乳酸杆菌广泛的分布在人体的消化系统以及泌尿生殖系统中,并且表现出对多种肿瘤的抑制作用。

1.1 乳酸杆菌对结肠癌的抑制

近年来,世界上结肠癌的发病率和死亡率急剧上升,已经成为世界上常见的恶性肿瘤之一,研究人员进行的大量研究已经证实,乳酸杆菌对结肠癌有明显的抑制作用。Sakatani等[8]研究发现短乳杆菌8803(Lactobacillusbrevis8803)产生的多聚磷酸盐(polyphosphate,poly P)能够通过激活胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路,诱导结肠癌SW620细胞凋亡,从而抑制结肠癌的发生,并且小鼠小肠原代培养细胞的活力不受poly P处理的影响,说明poly P对正常肠细胞的毒性较小。万莹[9]研究乳酸杆菌发酵液对人结肠癌SW620细胞的作用发现,乳酸杆菌发酵液能引起SW620细胞周期分布的改变,使细胞周期滞留在S期,阻碍其DNA的复制,从而发挥抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用,乳酸杆菌发酵液还可以上调促凋亡蛋白Caspase-3的表达,降低抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达,进而诱导SW620细胞凋亡。Elfahri等[10]在使用瑞士乳杆菌ASCC953(LactobacillushelveticusASCC953)、瑞士乳杆菌ASCC474(LactobacillushelveticusASCC474)、瑞士乳杆菌ASCC1188(LactobacillushelveticusASCC1188)和瑞士乳杆菌ASCC1315(LactobacillushelveticusASCC1315)发酵脱脂牛奶过程中,发现了具有抗结肠癌作用的生物活性化合物。Tiptirikourpeti等[11]在鼠结肠癌CT26细胞和人结肠癌HT29细胞中添加干酪乳杆菌ATCC393(LactobacilluscaseiATCC393),然后对结肠癌细胞活力进行测定,发现干酪乳杆菌ATCC393的浓度越大,作用时间越长,其抗结肠癌细胞增殖作用越明显,检测到与109CFU/mL干酪乳杆菌ATCC393孵育24 h的结肠癌细胞活力明显降低(HT29细胞活力降低了78%,CT26细胞活力降低了52%)。Zakuan[12]研究植物乳杆菌细菌素UL4对结直肠癌的作用时发现,UL4使IFN-γ、TNF-α、IL-12和IL-5的分泌增加,对结直肠癌细胞的生长具有显著的抑制作用。

1.2 乳酸杆菌对膀胱癌的抑制

用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)滴注是治疗膀胱癌的标准方法,但它有30%～50%的无应答率,并且还有许多副作用,而乳酸杆菌无毒副作用,可以抑制膀胱癌的恶化,延缓疾病进展。Seow等[13]研究发现,干酪乳杆菌Shirota(LactobacilluscaseiShirota)可以促使膀胱癌细胞凋亡,并且能够比BCG更有效地杀死膀胱癌细胞。在2010年,Seow等[14]又将分泌人前列腺特异性抗原的膀胱癌MB49细胞同位植入雌性C57BL/6小鼠中,形成膀胱癌模型小鼠,然后每周往小鼠膀胱中注射一次鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillusrhamnosus,LGG),持续6周,结果发现,LGG能够使大量的嗜中性粒细胞和巨噬细胞到达肿瘤部位,并且其治愈率达到了89%。另外,据报道,在经尿道膀胱癌切除术后,膀胱内注射表阿霉素可以预防浅表性膀胱癌复发,而口服干酪乳杆菌可以增强表阿霉素这一作用。Naito等[15]将202名做过经尿道膀胱癌切除术的浅表性膀胱癌患者,随机分配为注射表阿霉素组(102人)和注射表阿霉素加口服干酪乳杆菌(Yakult Honsha,日本东京)组(100人),研究表明,注射表阿霉素加口服干酪乳杆菌组(74.6%),3年内无复发率明显高于注射表阿霉素组(59.9%)。

1.3 乳酸杆菌对乳腺癌的抑制

乳腺癌是全世界女性发病率和死亡率非常高的疾病之一,常规治疗使用的药物具有很大的副作用,影响患者的生活质量,许多研究发现,无毒副作用的乳酸杆菌对乳腺癌有很好的抑制作用。Maroof等[16]研究表明,用嗜酸乳杆菌喂食乳腺癌模型小鼠,可降低肿瘤生长速率,还能够加快淋巴细胞增殖,增加IFN-γ、IL-4和TGF-β等细胞因子的分泌,从而对乳腺癌产生抑制作用。乳酸杆菌可以通过抑制乳腺癌细胞的外渗和转移,从而抑制乳腺癌的恶性发展。Aragon等[17]研究表明,喂食干酪乳杆菌CRL431(LactobacilluscaseiCRL431)发酵乳的乳腺癌模型小鼠,其肿瘤血管分布、肿瘤细胞外渗和肺转移减少,进而对乳腺癌起到明显的抑制作用。Lakritz等[18]给饮食或者遗传易感性导致乳腺癌的小鼠喂食罗伊氏乳杆菌ATCC-PTA-6475(LactobacillusreuteriATCC-PTA-6475),结果表明,其能够明显抑制乳腺癌的发展。此外,日本的一项研究表明,女性经常食用含有干酪乳杆菌Shirota和大豆异黄酮的饮料可以降低乳腺癌的发病率[19]。

1.4 乳酸杆菌对宫颈癌的抑制

1.5 乳酸杆菌对胃癌的抑制

最近,饮食成分的化学预防已成为控制胃癌发病率的新方法,乳酸杆菌作为潜在的饮食胃癌预防剂受到了很多关注。Linsalata等[22]研究表明,提高浓度的LGG匀浆可以降低鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)的活性,进而减少了多胺(可致胃癌)的生物合成,也可以提高亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase,SSAT)的活性,进而增加了多胺的分解,最终使多胺的含量下降,以此来预防胃癌的发生。另外,还有研究表明,提高浓度的LGG匀浆可抑制胃癌HGC-27细胞的生长,并且能够诱导其细胞凋亡[23]。

图1 乳酸杆菌抗肿瘤作用机制Fig.1 Lactobacillus anti-tumor mechanism

1.6 乳酸杆菌对其他癌症的抑制

除此之外,乳酸杆菌还可以对其他肿瘤产生较好地抑制作用。Zhang等[24]在4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquioline 1-oxide,4NQO)诱导的口腔癌大鼠中,研究唾液乳杆菌REN(LactobacillussalivariusREN)的体内抗癌活性,结果显示,唾液乳杆菌REN通过保护DNA免受氧化损伤和下调COX-2表达来抑制口腔癌的发生,高剂量唾液乳杆菌REN(5×1010CFU/kg体重/d)喂养的大鼠中检测到的肿瘤发生率显著降低(从65%降低至0%)。有研究报道,第1 d将艾氏腹水瘤(ehrlich ascites tumor,EAT)细胞从腹腔植入到小鼠体内,随后每天给小鼠腹腔中注射嗜酸乳杆菌,第8 d处死小鼠以确定嗜酸乳杆菌对EAT细胞增殖的影响,结果表明,EAT细胞的增殖显著减少[25]。有资料显示,给肿瘤模型小鼠喂食格氏乳杆菌TMC0356(LactobacillusgasseriTMC0356),可明显抑制小鼠移植性肉瘤S-180细胞和肝癌H22细胞的生长[26]。在很多研究中已经得到证实,乳酸杆菌还能够抑制B16黑色素瘤、Lewis肺癌、Meth A纤维瘤和淋巴瘤等多种肿瘤的发生、生长、转移及复发[27]。

2 乳酸杆菌的抗肿瘤作用机制

综合国内外学者长期的研究发现,乳酸杆菌的抗肿瘤作用机制主要可以从四个方面进行阐述,即抑制肠道内致癌物质的生成、激活机体的体液免疫、激活机体的细胞免疫和促进肿瘤细胞凋亡。其中,乳酸杆菌抑制肠道内致癌物质的生成,直接避免了致癌物生成后对机体产生有害影响;而乳酸杆菌激活机体的体液免疫，在抗肿瘤过程当中可起到辅助的作用;乳酸杆菌能够激活机体的细胞免疫系统在其抗肿瘤过程中是非常重要的,细胞免疫应答中的一系列反应可以对肿瘤细胞产生抑制或者直接杀伤的作用;乳酸杆菌可以促进肿瘤细胞凋亡,这也是乳酸杆菌抗肿瘤作用中很值得关注的一方面。

2.1 抑制肠道内致癌物质的生成

乳酸杆菌是消化系统中的优势菌群,与消化道粘膜上皮细胞互相作用后,可共建生理屏障,起占位性保护的作用,能够竞争性的抑制病原微生物对肠道上皮细胞的侵袭和定植[2]。乳酸杆菌产生的代谢产物(如乳酸、H2O2和细菌素等)对病原微生物起到拮抗作用,可有效抑制病原微生物的入侵,减少病原微生物产生的致癌酶,显著降低病原微生物的活性,从而抑制了前致癌物质向致癌物质的转化,维持肠道中的微生态平衡[2]。除此之外,有资料报道,乳酸杆菌能结合致癌物质,然后随粪便一起排出,减少致癌物质在体内的活化以及滞留[28]。

2.2 激活机体的体液免疫

体液免疫在抗肿瘤免疫机制中并不是重要的因素,但是在某些抗肿瘤免疫应答过程中起着辅助、协同的作用。肿瘤患者血清中能够检测到对肿瘤进行免疫应答的抗体,这说明体液免疫在抗肿瘤免疫应答过程中起着一定的作用,例如介导ADCC等作用。Yasutake等[29]在1985年就发现,在小鼠腹腔接种干酪乳酸杆菌YIT9018(LactobacilluscaseiYIT9018)和纤维肉瘤细胞的混合物后,第5 d检测到血清补体依赖性肿瘤细胞毒性抗体的产生,并且,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)在腹腔的接种位置检测到了针对肿瘤细胞的结合性抗体,而在只接种纤维肉瘤细胞的对照组中未发现这些抗体。另有研究表明,干酪乳杆菌可以通过增加IgA分泌细胞的数量和提高肠液中IgA的水平来保护宿主免于伤寒沙门氏菌的侵染[30]。

2.3 激活机体的细胞免疫

2.3.1 激活巨噬细胞 在抗肿瘤免疫过程中,巨噬细胞不仅作为抗原提呈细胞,而且对肿瘤细胞具有杀伤作用,是机体非特异性免疫系统中重要的免疫细胞之一。有资料显示,乳酸杆菌能够激活巨噬细胞,并增加其表面受体含量,从而增强其吞噬的功能,也可以使巨噬细胞的非特异性酯酶(non-specific esterase,NSE)和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)的含量及活性增加,增强其细胞毒性作用;乳酸杆菌还能够促使巨噬细胞产生一些效应因子(NO、TNF-α、IL-12和IFN-γ等)来杀伤肿瘤细胞。王红艳等[31]用嗜酸乳杆菌活菌、灭活菌与人巨噬细胞以10∶1、1∶1混合作用24 h后,巨噬细胞的吞噬活性明显增强,经体外细胞毒性实验发现,两者互相作用后显著增强了巨噬细胞对人宫颈癌HeLa细胞的细胞毒性作用。有文献报道,将从健康女性生殖道分离的三株乳酸杆菌,以1010CFU/只的剂量注射到宫颈癌U14移植瘤模型小鼠腹腔内,连续注射10 d,检测结果表明,小鼠巨噬细胞的吞噬指数与吞噬率都有显著提高,巨噬细胞的平均吞噬指数和吞噬率可以分别达到5.37%、78.59%;并且经三株乳酸杆菌作用过的三组巨噬细胞,产生的NO、TNF的量也明显增加,对小鼠的U14移植瘤均产生较强的抑制作用,抑制率都大于35%[32]。

此外,乳酸杆菌的细胞壁肽聚糖(whole peptidoglycan,WPG)也能够激活巨噬细胞的活性,提高巨噬细胞的吞噬率及吞噬指数,还能够提高巨噬细胞产生的IL-12和TNF-α等效应因子的水平,从而增强对肿瘤细胞的杀伤活性。

2.3.2 增强NK细胞的杀伤活性 自然杀伤(nature killer,NK)细胞属于淋巴谱系,也称为“大颗粒淋巴细胞”(large granular lymphocyte,LGL),主要分布在外周血中,占外周血淋巴细胞的5%～10%左右,在细胞免疫中,NK细胞属于非特异性成分,不需要活化就能够直接杀伤肿瘤细胞,并且无MHC限制性和肿瘤特异性。Takagi等[33]给C3H/HeN小鼠注射3-甲基胆蒽诱导肿瘤发生,从注射那天开始,在小鼠饮食中添加干酪乳杆菌Shirota(0.05%,w/w),第5周后发现,小鼠NK细胞的数量明显增加,其对肿瘤细胞的毒性作用明显增强,从而延缓了肿瘤的发生,并且降低了肿瘤的发生率。Soltan等[34]在肿瘤移植前2周的每一天,给小鼠喂食0.5 mL含有2.7×108CFU/mL干酪乳杆菌的PBS溶液,并在肿瘤移植后3周内,每隔3 d和原来一样喂食一次,结果显示,喂食干酪乳杆菌能显著增加小鼠脾细胞培养物中IL-12和IFN-γ的产生,增强其NK细胞的杀伤活性,和对照组相比,实验组小鼠存活时间明显延长且肿瘤的生长速率显著降低。Kato等[35]将干酪乳杆菌YIT9018(250 μg)静脉注射到含Meth A纤维瘤的小鼠中,检测结果显示,小鼠注射干酪乳杆菌YIT9018后,其NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性增强了两倍。

2.3.3 增强T细胞介导的免疫应答反应 在抑制肿瘤细胞的形成和生长过程中,T细胞介导的免疫应答反应起着极其重要的作用。其中细胞毒性T细胞(CTL,CD8+)需要在双重信号作用下充分活化和克隆增殖,即经内源途径加工后的肿瘤抗原肽和MHC-Ⅰ类分子结合,在细胞表面表达并经呈递,与CD8+表面的TCR-CD3的复合物相结合,还要在辅助T细胞(Th,CD4+)产生的细胞因子的帮助下,能够活化形成CD8+CTL,CD8+CTL通过穿孔素、颗粒酶系统和Fas/FasL介导直接杀伤肿瘤细胞。而且,带有MHC-Ⅱ类分子的肿瘤细胞抗原将Th活化形成CD4+Th后,CD4+Th产生的细胞因子能够使肿瘤细胞MHC-Ⅰ更多地表达,提高了对CD8+CTL的敏感性[36]。有学者分别用干酪乳杆菌和长双歧杆菌的细胞质部分喂食Balb/c小鼠,在第14 d时将F9畸胎瘤细胞接种到小鼠体内,连续喂食4周后,用流式细胞仪检测发现,小鼠的总T细胞、NK细胞、CD4+细胞和CD8+细胞的数量明显增加,而且发现干酪乳杆菌和长双歧杆菌的细胞质部分对其肿瘤有抑制作用,还可延长小鼠的生存期[37]。阿木尔吉日嘎拉[38]将干酪乳杆菌zhang(Lactobacilluscaseizhang)制成活菌数为2.0×1010～3.0×1010CFU/mL的乳的悬浮液(菌液),用嗜酸乳杆菌MG2-1(LactobacillusacidophilusMG2-1)制成活菌数为2.0×108～3.0×108CFU/mL的发酵乳,然后按不同的剂量灌服小鼠,在第10、20、30 d时,用流式细胞仪测定后发现,给小鼠灌服上述菌液和发酵乳均明显提高了小鼠的外周血中CD4+细胞与CD8+细胞的含量,优化了CD4+细胞/CD8+细胞的比值,增强了小鼠的细胞免疫功能。

2.3.4 增加细胞因子的分泌 细胞因子是在细胞间发送信号、诱导生长、趋化、活化、增强细胞毒性和调节免疫的小分子物质,可直接杀伤肿瘤细胞,也可调节巨噬细胞、NK细胞以及B细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。大量的研究表明,乳酸杆菌能够刺激巨噬细胞、NK细胞以及B细胞,增加对TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-12和NO等细胞因子的分泌,从而增强机体的抗肿瘤能力。Yazdi等[39]在给BALB/c小鼠注射乳腺癌4T1细胞的前两周,每只小鼠每日灌服2.5×108CFU/mL的富含硒纳米颗粒的植物乳杆菌悬浮液0.5 mL,结果显示,小鼠的脾细胞培养物中的IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α含量明显增加,NK细胞活性增强,小鼠的肿瘤体积减少且存活率显著增加,其抗肿瘤效果明显增强。Matsuzaki[40]将干酪乳杆菌从胸腔注射入肿瘤小鼠体内,研究发现,小鼠胸腔中的IFN-γ和TNF-α含量显著增加,从而抑制胸腔中肿瘤细胞的生长,并明显延长小鼠的生存时间。Shi等[41]连续3 d给BALB/c小鼠体内注射乳酸杆菌的细胞壁肽聚糖,研究其对结肠肿瘤组织的抑制作用,检测结果发现,小鼠体内IL12和IFN-γ含量增加,巨噬细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的活性显著增强,从而对肿瘤起到明显的抑制作用。Hu等[42]给BALB/c小鼠预先连续14 d灌服植物乳杆菌后,再给小鼠接种结肠腺癌CT26细胞构建肿瘤模型,实验结果显示,给该肿瘤模型小鼠预先灌服植物乳杆菌能明显增加IFN-γ的分泌,增加了CD8+和NK细胞向肿瘤组织中浸润的效应功能,从而明显抑制肿瘤细胞的生长,延长小鼠的生存时间。

2.4 促进肿瘤细胞的凋亡

细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的主动有序的死亡过程,肿瘤治疗最理想的方法之一是诱导肿瘤细胞凋亡,大量实验证明,乳酸杆菌可以促进肿瘤细胞凋亡。Soltan等[43]用乳酸杆菌的上清液和乳酸杆菌的提取物分别处理结肠癌Caco-2细胞后发现,二者均可以明显抑制Caco-2细胞增殖和促进Caco-2细胞凋亡,并且二者还能够抑制Caco-2细胞的迁移。李秀真等[44]在研究乳酸杆菌对小鼠宫颈癌U14细胞凋亡的作用中,采用TUNEL法来检测U14细胞的凋亡指数,结果表明,乳酸杆菌组的U14细胞凋亡指数达到11.25%±4.06%,和对照组差异性显著。Hwang等[45]将0.5 mg/mL的干酪乳杆菌和胃癌KATO3细胞一起孵育48 h后,检测结果显示,KATO3细胞的生长得到显著抑制,抑制率达到50%,并诱导大部分KATO3细胞凋亡;在共同孵育72 h后,11.55%的KATO3细胞处于凋亡早期,85.62%的KATO3细胞处于凋亡晚期。此外,研究证实,很多乳酸杆菌的细胞壁可以刺激巨噬细胞和其他免疫细胞产生NO,NO能使核酸亚硝基化,导致DNA断裂,从而促进肿瘤细胞凋亡[46]。

3 展望

综上所述,乳酸杆菌是一种天然的抗肿瘤物质,这为人们治疗肿瘤提供了一条新思路,目前,乳酸杆菌的抗肿瘤作用,已成为国内外专家和学者研究的热点。就当下研究现状来看,乳酸杆菌抗肿瘤的研究正处于由表象的观察向机制的深入研究转变,进一步确定乳酸杆菌与相关癌症的免疫途径。关于乳酸杆菌对肿瘤的发生和生长的影响,以及乳酸杆菌刺激抗肿瘤分子信号产生、激活免疫细胞活性、增加细胞因子分泌和诱导肿瘤细胞凋亡的具体信号通路等机制,现在还未彻底研究清楚。因此,进一步从分子水平和基因水平深入研究乳酸杆菌及其代谢产物的抗肿瘤作用,对乳酸杆菌和重组基因工程乳酸杆菌预防、治疗肿瘤有指导性意义,为新型抗肿瘤药物的开发提供理论依据,可加快生物技术防治肿瘤的发展。