自然发酵酸菜化学成分含量和微生物数量的动态变化及其相关性分析

韩宏娇,丛 敏,李欣蔚,孔繁华,李玮轩,梁肖娜,曹雪妍,岳喜庆

(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110161)

酸菜是深受东北人民喜爱的一种传统的发酵制品。经过发酵后的蔬菜制品,不仅营养价值提升,而且口味独特。其浓郁酸香的口感得益于发酵过程中微生物代谢的复杂变化。在整个发酵过程中,发酵液中各项化学指标以及微生物数量的变化对酸菜发酵品质、风味和贮藏特性等起着至关重要的作用[1]。要实现酸菜由传统自然发酵转变为人工可调控发酵,必须准确掌握发酵过程中的微生物和化学成分的动态变化,这对于形成口感佳、风味好和质量高的产品尤为重要[2-4]。

目前,国内外对于自然发酵酸菜的研究主要是利用高新技术研究微生物区系的动态变化以及乳酸菌的分离和种类鉴定,人工接种发酵酸泡菜在发酵过程中的亚硝酸盐含量变化和风味成分分析。而对自然发酵酸菜尤其是东北酸白菜及其发酵液的化学成分和微生物数量随发酵时间的动态变化规律及相关性分析研究还鲜有报道。

本研究拟对东北地区自然发酵第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、35、40、50、60 d的酸菜及发酵液中的乳酸菌数、酵母菌数、大肠菌群数和细菌菌落总数、pH、总酸度、亚硝酸盐含量、可溶性蛋白含量、还原糖含量和氨基酸态氮含量进行了系统分析,并研究各项化学成分含量和微生物数量之间的相关性,以期为酸菜发酵工艺的优化及工业化生产提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大白菜 沈阳农业大学农贸市场;乙酸锌、亚铁氰化钾、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、3,5-二硝基苯磺酸、结晶酚、考马斯亮蓝G-250 分析纯,鼎国生物技术有限公司。

ALC-210.2型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;AL204分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;LDZX-50FBS全自动高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;ZHJH-C1214C超净工作台 青岛海尔特种电器有限公司;ZHJH-C1213C无菌操作台 青岛海尔特种电器有限公司;DNP型电热恒温培养箱 上海精宏实验仪器设备有限公司;ND-2000型紫外分光光度计 北京中西科技远大有限公司;DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验仪器设备有限公司;pHS-3C型精密pH计 上海理达仪器;5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酸菜的腌制 采用中国东北地区酸菜腌制的传统方法。挑选结实饱满且成熟,无腐烂,无病虫害的大白菜,将其在通风且阳光充足的室外晾晒数日后(晒蔫、杀菌、去除一定的水分),去除黄叶、老帮并清洗干净,将整颗大白菜浸入沸水3 min左右后捞出,沥干水分,整齐摆入5L的发酵罐中装满压实并排出空气,用质量分数为3.0%淡盐水将发酵罐填满密封,不添加任何发酵剂和调味料。用塑料布将发酵罐口扎紧,将酸菜发酵罐放置在温度20～25 ℃,湿度40～65%且避光阴凉的环境中进行自然发酵,取0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、35、40、50、60 d的酸菜及发酵液进行如下指标的测定。

1.2.2 化学成分指标的测定 pH:取酸菜发酵罐中多个位置的发酵液进行混合,校准pH计后,将电极浸没在发酵液中直至数值稳定。连续测定三次取平均值作为最终结果;

总酸度[5]:参考GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》,取酸菜10.00 g研磨成匀浆，蒸馏水定容至100 mL，过滤备用，采用酸碱滴定法对发酵悬浊液进行测定;

亚硝酸盐含量[6]:取酸菜500 g研磨成浆，参照GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定》,制备酸菜样品的亚硝酸盐提取液，采用盐酸萘乙二胺法对发酵悬浊液进行测定,以亚硝酸钠含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:y=0.0162x+0.0053,R2=0.9981,呈线性关系;

可溶性蛋白含量[7]：取酸菜2.00 g研磨成匀浆，与5 mL去离子水混合后在4 ℃，12000 r/min的条件下离心30 min，上清液即为酸菜可溶性蛋白提取液。参照GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》，采用考马斯亮蓝染色法对酸菜样液进行测定，以蛋白质含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.0057x+0.0121，R2=0.9983，呈线性关系；

还原糖含量[8]：取酸菜1.00 g研磨成匀浆，定容至25 mL，80℃水浴30 min使还原糖充分溶出，过滤后定容至100 mL即为酸菜还原糖提取液。参照GB/T 5009.7-2008《食品中还原糖的测定》，采用3,5-二硝基水杨酸比色法对酸菜样液进行测定，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.3074x-0.0012，R2=0.9992，呈线性关系；

氨基酸态氮含量[9]:甲醛滴定法,取酸菜样品10 g,研磨成匀浆状,去离子水定容至100 mL,摇匀后过滤,取滤液20 mL与60 mL蒸馏水混合。用0.05 mol/L的标准碱液调节溶液pH至8.2(V1)。再加入10 mL甲醛溶液,再调节pH至9.2(V2)。用去离子水(V0)作为空白对照,计算如下:

1.2.3 微生物指标的测定 采用纯培养法,将发酵第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、35、40、50、60 d的发酵液用25 mL离心管收集,经过四层无菌纱布过滤后,取滤液作为研究对象进行微生物指标的测定。细菌菌落总数[10]:参照GB 4789.2-2010,釆用平板计数法测定细菌菌落总数;乳酸菌总数[11]:参照GB 4789.35-2010,釆用平板计数法测定乳酸菌数量;酵母菌数量[12]:参照GB 4789.15-2010,采用平板计数法测定酵母菌数量;大肠菌群数[13]:参照GB 4789.3-2010,采用平板计数法测定大肠菌群数量。

1.3 数据处理

用Excel和SPSS 17.0对试验数据进行绘图和统计分析。

2 结果与分析

2.1 酸菜自然发酵过程中pH的动态变化

pH是酸菜发酵过程中的重要指标。pH不仅会影响发酵环境中微生物的种类、数量和生长状况,还会影响微生物的代谢途径及其代谢产物的变化,进而影响发酵风味的形成[3]。

自然发酵酸菜pH随发酵时间的动态变化如图1所示。在发酵时间为0～35 d时,pH逐渐下降,从初始的6.42下降为3.64。在发酵时间为40～60 d时,pH在3.70左右保持平稳。Xiong等[14]认为,发酵初期乳酸菌的生长处于劣势,发酵环境中产酸较少。随着发酵时间的延长,乳酸菌在厌氧环境中利用大白菜中的还原糖发酵,产生大量的乳酸等酸性物质,使pH不断下降[15]。在酸菜发酵40～60 d,pH变化较小。杜书[16]和马欢欢等[17]研究表明,pH随发酵时间的延长而下降,最终稳定在pH3左右,与本文结果类似。

图1 酸菜自然发酵过程中pH的动态变化Fig.1 Dynamic changes of pH during natural fermentation of sauerkraut

2.2 酸菜自然发酵过程中总酸含量的动态变化

如图2所示,酸菜发酵环境中的总酸含量呈持续上升趋势,在发酵时间为50 d时达到最大值6.68 g/kg,在发酵时间为50～60 d时基本保持稳定。Liu等[18]发现,乳酸菌在发酵蔬菜中的作用主要是形成酸性环境和抑制不耐酸有害菌的生长。且乳酸菌是发酵体系中的主体微生物[19]。因此,在酸菜腌制初期,发酵环境中以肠膜明串珠菌的异型发酵为主,产生的CO2、CH3COOH和CH3CH2OH导致发酵液的总酸含量升高[20]。由此创造的酸性环境促进部分抗酸乳酸菌的繁殖,产生大量乳酸,总酸含量持续增加。而在发酵时间为50 d之后,发酵环境中的碳源和氮源因被大量消耗而不足,乳酸菌数量趋于稳定,其产酸作用减弱并逐渐停止,发酵环境中总酸含量趋于稳定。乳酸菌发酵食品的酸味及风味受其总酸度的影响较大[21]。自然发酵酸菜中的适量酸有助于掩盖白菜味,同时赋予制品独特的风味。

图2 酸菜自然发酵过程中总酸含量的动态变化Fig.2 Dynamic changes of total acid content during natural fermentation of sauerkraut

2.3 酸菜自然发酵过程中亚硝酸盐含量的动态变化

在腌制初期,发酵体系内酸度较低,蔬菜本身及发酵器具上携带的肠杆菌和黄杆菌属等革兰氏阴性菌会分泌硝酸还原酶,蔬菜中的大量硝酸盐还原为亚硝酸盐[22]。由图3所示,酸菜的亚硝酸盐含量在发酵时间为0～9 d时急剧增加,并在9 d时达到最大值69.76 mg/kg。何淑玲等[23]发现,硝酸还原酶产生作用的临界点为pH5.0,且硝酸还原酶酶活性对亚硝酸盐含量变化规律起主要作用。由图3变化趋势结合2.1 pH变化规律,亚硝酸盐含量在发酵第15 d(pH4.99)后逐渐减小并趋于稳定,15 d之后降低到国家标准以下的水平,小于20 mg/kg。

图3 酸菜自然发酵过程中亚硝酸盐含量的动态变化Fig.3 Dynamic change of nitrite content during natural fermentation of sauerkraut

2.4 酸菜自然发酵过程中可溶性蛋白含量的动态变化

Do等[24]研究表明,LactobacillusdelbrueckiiUFV H2b20有编码合成蛋白质水解酶和氨基肽酶的基因,从而提高蛋白质的降解速率和消耗速率。由图4可知,在酸菜的自然发酵过程中,可溶性蛋白被分解为氨基酸和小肽等物质被微生物生长发育所利用,整体呈现下降趋势,从发酵时间为0 d时的49.85 mg/100 g下降到60 d的1.34 mg/100 g,下降了约37倍。在40～60 d时,可溶性蛋白含量趋于稳定,蛋白质代谢产物也为酸菜特殊风味和口感的形成提供了保证。

图4 酸菜自然发酵过程中可溶性蛋白含量的动态变化Fig.4 Dynamic change of soluble protein during natural fermentation of sauerkraut

2.5 酸菜自然发酵过程中还原糖含量的动态变化

由图5所示,发酵时间为0～9 d时,酸菜发酵体系中还原糖含量逐渐增大并达到最大值,分析原因可能是,随着发酵时间的不断延长和盐水的渗透压作用,导致大白菜本身的还原糖等营养物质不断溶出,此时微生物对还原糖的分解速率小于还原糖的生成速率。Dodds等[25]对TS4乳酸杆菌的研究表明还原糖和NADH是发酵环境中酶的主要电子供体。同时,还原糖在发酵后期作为微生物生长繁殖的主要碳源被消耗,其含量逐渐减少并趋于稳定,因此在发酵时间为9～60 d时整体呈现下降趋势。

图5 酸菜自然发酵过程中还原糖含量的动态变化Fig.5 Dynamic change of reducing sugar during natural fermentation of sauerkraut

2.6 酸菜自然发酵过程中氨基酸态氮含量的动态变化

微生物通过代谢活动产生蛋白酶,Lee等[26]研究发现,泡菜中的Lb.sakei能够分解蛋白质产生大量的必需氨基酸和肽类物质。如图6所示,酸菜发酵环境中氨基酸态氮含量在0～9 d逐渐增加,并在发酵时间为10 d时,达到最大值11.3 mg/100 g,这是由于初期微生物数量较少,且代谢活动较弱,因此酶解蛋白质作用较弱。在发酵时间为10～60 d时,整体呈现下降趋势,可能是由于高酸性的发酵环境抑制中性和碱性蛋白酶的活性,同时微生物代谢活动趋于平稳,氨基酸态氮含量趋于稳定。

图6 酸菜自然发酵过程中氨基酸态氮含量的动态变化Fig.6 Change of amino acid nitrogen during natural fermentation of sauerkraut

2.7 酸菜自然发酵过程中微生物数量的动态变化

如图7所示,自然发酵酸菜中乳酸菌数量、酵母菌数量、大肠杆菌数量和细菌菌落总数的变化趋势基本一致,细菌菌落总数、乳酸菌数量、酵母菌数量和大肠菌群数量均在发酵前期逐渐增加到峰值,出现峰值的时间分别为15、18、9、6 d,在发酵后期数量逐渐减少并趋于平稳的趋势,其中酵母菌数量在发酵40～60 d时略有上升,而大肠菌群数量在发酵20 d后变为零。Xiong等[19]对发酵圆白菜的研究表明,发酵过程中的主体微生物为乳酸菌。如图7所示在发酵第18 d时,乳酸菌数量到达峰值成为优势菌群。随后其数量开始减少,这是由于乳酸富集到1.1%～1.3%的浓度时,反而抑制了部分不耐酸乳酸菌的生长[16,27]。Mundt等[21]发现,甘蓝发酵初期乳酸菌和细菌总数急剧上升,同时伴随一定数量的霉菌和酵母菌,在发酵后期乳酸菌和细菌逐渐抑制其他杂菌,与本研究结果相符。分析原因认为,一方面随着发酵时间的延长,乳酸菌生长并大量产酸,酸性和低氧的发酵环境抑制了酵母菌和大肠菌群的生长[28]。另一方面,发酵环境中微生物生长所需要的营养物质如碳源和氮源不足,使得发酵液中乳酸菌的数量逐渐减少。发酵环境中微生物的交替生长为酸菜产生独特风味和提高贮藏品质提供了保证。

图7 酸菜自然发酵过程中微生物数量的动态变化Fig.7 Dynamic changes of microbial quantity during natural fermentation of sauerkraut

2.8 酸菜自然发酵过程中微生物数量变化与化学成分含量变化的相关性分析

将酸菜自然发酵过程中化学成分含量与各类微生物数量进行相关性分析,结果如表1所示。乳酸菌数与pH、大肠菌群数及可溶性蛋白含量呈极显著负相关(p<0.01),相关系数分别为-0.801、-0.697和-0.811。酵母菌数与亚硝酸盐含量、还原糖含量及氨基酸态氮含量呈极显著正相关(p<0.01),相关系数分别为0.934、0.811和0.874。大肠菌群数与pH、还原糖含量、可溶性蛋白含量及氨基酸态氮含量呈极显著正相关(p<0.01),与总酸含量呈极显著负相关(p<0.01),相关系数分别为0.869、0.830、0.665、0.813和-0.765。而细菌菌落总数与氨基酸态氮含量呈显著正相关(p<0.05)。pH与还原糖含量、可溶性蛋白含量和氨基酸态氮含量呈极显著正相关(p<0.01),与总酸含量呈极显著负相关(p<0.01),相关系数分别为0.858、0.851、0.773和-0.962。总酸含量与还原糖含量、可溶性蛋白含量和氨基酸态氮含量呈极显著负相关(p<0.01),相关系数分别为-0.948、-0.742和-0.818。

表1 酸菜自然发酵过程中微生物数量变化与化学成分变化的相关性分析Table 1 Correlation Analysis of the changes of chemical composition and microbial quantity in the process of sauerkraut fermentation

3 讨论

3.1 酸菜自然发酵过程中微生物数量与化学成分的动态变化

酸菜中乳酸发酵是主要的发酵类型,同时也有少量的乙醇发酵过程和微量的醋酸发酵过程[28]。此外,自然发酵酸菜的总酸含量随发酵时间的延长呈现上升趋势,pH随发酵时间的延长呈现下降趋势,因此,酸菜会呈现独特的酸味。在发酵过程中,发酵液中乳酸菌数量呈现先增加后逐渐减小并保持稳定的趋势,细菌菌落总数和大肠菌群数在发酵前期略有增加,之后逐渐减少,其中大肠菌群数在发酵20 d后数量变为零。酵母菌数量呈现先增加后降低在略上升的趋势。这些微生物数量的变化显著影响着发酵液中营养物质还原糖、可溶性蛋白和氨基酸态氮含量的变化,可溶性蛋白含量随着发酵时间的延长呈现不断下降的趋势,而还原糖和氨基酸态氮含量随着发酵时间的延长则略有上升后下降。在发酵过程中,亚硝酸盐含量的变化趋势为先增加后下降,最终在一定范围内波动并保持稳定,且发酵21 d后的酸菜产品已经符合国家标准。

3.2 酸菜自然发酵过程中微生物数量与化学成分含量之间的关系

酸菜发酵环境中的乳酸菌数与pH及可溶性蛋白含量极显著负相关(p<0.01)。Liu等[29]研究表明Lb.Plantarum能够合成蛋白水解酶基因的前体物质,可水解发酵体系中的蛋白质产生氨基酸。因此可溶性蛋白为乳酸菌的生长提供氮源。乳酸菌是发酵过程的优势微生物和产酸的主要微生物[19],且发酵体系中的酸度直接影响pH的变化。同时还发现,乳酸菌对大肠杆菌数量的消长规律有极显著影响且呈反向相关关系,这与杨丽等[30]的研究结果一致。

酵母菌数量与氨基酸态氮含量的相互关系与Beltran等[31]和Vilanova等[32]的研究结果相似,可同化氮是酵母菌生长的必需营养物质,其含量变化的消长规律与酵母菌数量保持同步。酵母菌数量与酸菜发酵体系中的还原糖具有极显著的正相关关系,可能是由于发酵环境中的其他营养物质限制了酵母菌对还原糖的消耗速率,也可能是酵母菌发酵需要一定浓度的还原糖存在。国内外均有研究表明,发酵蔬菜中亚硝酸盐的产生是由于肠杆细菌和黄杆菌属分泌的硝酸还原酶作用[22-33]。但亚硝酸盐含量与酵母菌数量呈极显著正相关的作用机理尚无定论,有待在后续研究中开展。

相关性分析发现大肠菌群的生长受到发酵体系中多种因素的影响,pH、还原糖含量、可溶性蛋白含量、氨基酸态氮含量及总酸含量对大肠菌群数的影响极显著。其中可溶性蛋白和氨基酸态氮作为发酵体系中的主要氮源促进大肠杆菌的生长发育。程立坤等[34]证明了葡萄糖浓度对大肠杆菌TRJTH0709的菌体生物量、菌体比生长速率等具有显著影响,与本文结果一致。但是pH及总酸含量与大肠菌群的关系与杨丽等[30]的研究存在一定的差异,这可能与发酵过程中是否添加调味料以及发酵液的盐浓度有关。

比较细菌菌落总数与其他指标的变化发现,细菌菌落数量仅与氨基酸态氮含量有显著的正向相关关系。因此,除乳酸菌外,氨基酸态氮含量是发酵酸菜中其他微生物生长的关键因子。

4 结论

东北酸菜自然发酵过程中的氨基酸态氮含量是影响发酵体系内微生物生长的主要营养物质。随发酵时间的延长,pH和可溶性蛋白的含量下降,总酸含量上升,还原糖、亚硝酸盐和氨基酸态氮含量均先增加后减小。细菌菌落总数、大肠菌群数和乳酸菌数量先增加后减少,大肠菌群数最后为零。酵母菌数量先增加后降低,最后略有上升。发酵体系中化学成分含量和微生物数量相关性显著(p<0.05)。乳酸菌则受到大肠杆菌和可溶性蛋白含的极显著影响(p<0.01)。而大肠菌群数则受诸多化学成分含量的影响,在发酵20 d后数量变为零。酵母菌数量极显著地影响还原糖、氨基酸态氮和亚硝酸的含量(p<0.01),其与亚硝酸盐的关系可以进一步研究,为解决发酵蔬菜中亚硝酸盐的积累问题提供理论依据。