不同发酵时间甜酒酿面团的超微结构与面包香气特征研究

吴玉新,张可欣,蒋 慧,汤晓娟,徐 岩,黄卫宁,*,李 宁,Filip Arnaut

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122;2.广州焙乐道食品有限公司,广东广州 511400;3.焙乐道食品集团,比利时布鲁塞尔 B1702)

面包具有丰富的营养、细腻的口感,是一种美味又健康的食品。从传统意义上来说,面包是由高筋粉为主要原料,与水以及发酵剂经过搅拌、发酵和烘焙而成。随着人们生活水平的提高,对面包的风味口感以及营养的要求越来越高,因此研发新的优良风味、营养健康的面包势在必行。

甜酒酿在中国民间流传已久。甜酒酿是利用酒曲中的微生物,以糊化的糯米为原料,利用酒曲中的根霉和米曲霉将糊化后的淀粉糖化,水解成低分子的糖类物质,酿酒酵母利用糖化产物产生醇类物质,给酒酿带来独特的风味[1]。乳酸菌产生乳酸、乙酸等酸味物质,调节酒酿体系中的pH,并在酶的作用下与醇类物质反应生成酯类化合物,使得酒酿具有宜人的香气[2]。甜酒酿具有营养丰富且风味独特的特点,已被广泛应用于谷物加工产品中。李志建等[3]在馒头中添加甜酒酿来改善馒头的风味。黄璐等[4]在面包中添加酒酿滤汁,发现制得的面包储藏期得到延长,风味也得到改善。但是由于酒酿中固形物含量大于50%[5],若将固形物丢弃就会造成巨大的浪费。

因此,本文旨在研究添加不同发酵时间甜酒酿的面团中蛋白酶和微观结构的变化以及面包的风味化合物特征,探索出最佳发酵时间,以期为酒酿面包的品质改善提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜酒曲 广西酒曲(GX);即发活性干酵母 乐斯福(明光)有限公司;黄油 福临门(张家港)有限公司;小麦粉 中粮集团有限公司;粳糯米、食盐、白砂糖 市售;氢氧化钠、茚三酮、甘氨酸、氯化钠 国药集团化学试剂有限公司;罗丹明B、异硫氰酸荧光素(FITC) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;OTC冰冻切片包埋剂 徕卡显微系统(上海)贸易有限公司。

WSYH26A中式电蒸锅 广东美的生活电器制造有限公司;BSC-250恒温恒湿箱、HHS-21-4电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SCION SQ 456-GC四级杆质谱气质联用仪 美国布鲁克公司;75 μm CAR/PDMS 固相微萃取头 美国Supel-co公司;CM1950冰冻切片机 德国徕卡公司;LSM710激光共聚焦显微镜 德国蔡司公司;SM-25搅拌缸、SPC-40SP醒发箱、SM-503电烤炉、SM302N切片机 新麦机械(无锡)有限公司;CT3质构分析仪 美国Brookfield公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甜酒酿的制备 称取250 g糯米,在自来水(500 g左右)中浸泡5 h左右,称取浸泡后的糯米380 g,大火蒸制10 min后,在糯米表面淋少量水,再蒸制20 min,冷却,待温度降至36～38 ℃后,拌入甜酒曲(接种量0.5% w/w),最后放置在30 ℃,湿度85%条件下分别发酵0、24、48、72 h。

1.2.2 甜酒酿pH及总可滴定酸度(TTA)测定 根据王益姝等[6]的方法测定不同发酵时间的甜酒酿的pH和TTA。分别称取不同发酵时间(0、24、48、72 h)的甜酒酿10 g,量取90 mL的蒸馏水,放入搅拌子,置于磁力搅拌器上搅拌均匀静置10 min后测定pH。随后用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至pH为8.6时消耗NaOH的毫升数即为TTA。

1.2.3 甜酒酿面团和面包的制备 制备总粉质量为300 g的小麦面团体系,加入酵母4.5 g、盐3 g、糖18 g和水165 g,放入搅拌缸中搅拌,先慢速(60 r/min)搅拌2 min,再快速(120 r/min)搅拌4 min。而后将12 g的黄油倒入搅拌缸中,先慢速搅拌1 min至面团将黄油全部吸收,再快速搅拌3 min至面筋网络形成。面团静置松弛5 min,经切割、搓圆后再静置5 min,整型后放入醒发箱(温度38 ℃,相对湿度85%)中醒发65 min,最后放入烤箱中上火170 ℃,下火210 ℃烘焙21 min。甜酒酿面包则用发酵48 h的10%甜酒酿代替小麦粉制作。

1.2.4 甜酒酿面团的面筋蛋白与超微结构

1.2.4.1α-氨基态氮的测定 称取1.25 g冻干粉(未添加酵母的醒发前后的面团冻干所得),加入25 mL 1 mol/L的NaCl溶液,震荡摇匀,离心(18000×g,4 ℃,30 min)取上清液,参考Thiele等[7]的方法用茚三酮测定上清液中可提取α-氨基态氮的含量,以甘氨酸为标样制备标准曲线(y=0.3366x+0.0638,R2=0.9996),并进行重复实验三次。

1.2.4.2 甜酒酿面团超微结构 根据1.2.3的配方制备面团,为排除酵母产气的影响,故不添加酵母[8]。通过激光共聚焦显微镜观察面团的超微结构,用剪刀剪取2 g左右的面团于冷冻切片的托盘上,用Leica胶将面团完全包裹,在-20 ℃冰箱中冻藏约4～5 h至内部面团冻实,在冰冻切片机上切片处理,切取20 μm的薄片。根据Silva等[9]描述的方法,以丙酮为溶剂,配制0.25%(w/w)的异硫氰酸荧光素(FITC)和0.025%的罗丹明B荧光染料。将染色液覆盖到切片上静置2 min后,用蒸馏水脱色,吸去多余水分,盖上载玻片,在激光共聚焦显微镜下进行观察。设置目镜的放大倍数为10×,物镜放大倍数为20×。FITC和罗丹明B的激发/发射波长分别为488/518 nm和568/625 nm。

1.2.5 甜酒酿面包的比容与香气化合物分析

1.2.5.1 甜酒酿面包风味测定 用镊子夹取面包芯,称取5 g样品置于样品瓶中,插入已老化的75 μm Car/PDMS萃取头,在60 ℃恒温水浴中顶空萃取40 min,随后进样,于250 ℃解吸3 min,同时启动仪器采集数据。

气相色谱条件[10-11]:DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),载气为He,流速0.8 mL/min,起始温度40 ℃,3 min后以5 ℃/min升温至90 ℃,随后以10 ℃/min升温至230 ℃,保持7 min。

质谱条件:电离方式为EI,放射电流80 μA,电子能量70 eV,界面温度250 ℃,离子源温度200 ℃。全扫描进行采集,扫描范围为质荷比15～300。通过GC-MS分析软件系统完成实验数据的处理。

1.2.5.2 甜酒酿面包的比容测定 面包烘烤后在室温下冷却2 h,采用菜籽置换法[12]测定面包的比容,计算公式如下:

式(1)

1.2.5.3 感官评定 采用九分嗜好法对空白面包(WB)和甜酒酿面包(FRB)进行感官鉴评[11]。评分小组由20名(10名女性,10名男性)受到感官鉴评专业训练的人员组成,从9分到1分表示从喜欢到不喜欢。

1.3 数据分析

运用Excel 2013对数据进行计算整理、Origin 9.1绘制图表、SPSS 16.0分析数据之间的显著性差异,p<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 甜酒酿发酵过程中pH和TTA变化

由于在甜酒酿发酵早期,酒曲中的霉菌代谢产生琥珀酸、乙酸以及苹果酸等有机酸[14],所以甜酒酿的pH不断下降,在18 h后基本稳定在4.0左右,达到面团发酵剂的适宜pH。随着有机酸的不断积累,TTA也逐渐在20 h时增至7.98并趋于稳定。pH和TTA能显著影响酒酿发酵液中的蛋白酶和淀粉酶等的酶活[15],使面团具有较好的加工品质,并最终影响面包品质[16]。当发酵至48 h后,甜酒酿的TTA基本趋于稳定,这与Wu等[17]的测定结果相似。

图1 甜酒酿发酵过程中pH与TTA的变化Fig.1 Changes of pH and TTA value during fermentation of fermented glutinous rice

2.2 甜酒酿面团的蛋白水解程度与超微结构

2.2.1 不同发酵时间甜酒酿对面团蛋白水解程度的影响 蛋白酶是面包发酵过程中的关键酶之一,少量的蛋白酶有利于面团网络结构的稳定,过量的蛋白酶则会对面团产生负面影响。通过游离α-氨基态氮的含量表征含甜酒酿面团中蛋白水解程度,Thiele等[7]及Loponen等[18]均采用这种方法来测定酸面团中蛋白质的水解程度。如图2所示,各实验组面团中的α-氨基态氮含量在醒发后差异变大,除发酵0 h甜酒酿面团(FRD)外,所有面团在醒发后α-氨基态氮含量都得到增加,这与Huang等[15]的研究结果相似。在甜酒酿中,酒曲中的霉菌除了有较强的淀粉水解和蛋白质水解活性[19],随着甜酒酿发酵时间的延长,霉菌的菌丝和孢子开始自溶,也会释放蛋白酶[20]。因此,推测添加了不同发酵时间的甜酒酿的面团在醒发后,蛋白质水解程度显著增加,一部分的蛋白质水解有利于将糯米中的蛋白质分解成小分子的氨基酸,形成一种可以包含更多气体的结构。但是过量的蛋白酶则会降解小麦蛋白,弱化面筋,对面包质构产生负面影响,所以优选出最佳蛋白酶酶活的发酵时间尤为重要[20]。

图2 不同发酵时间甜酒酿面团发酵前后可提取α-氨基态氮含量Fig.2 Extractable α-amino nitrogen content in dough before and after fermentation with fermentedglutinous rice in different fermentation time注:图中不同小写字母代表醒发前或醒发后不同发酵时间的差异显著性(p<0.05)，图5同。

2.2.2 不同发酵时间甜酒酿对面团超微结构的影响 图3描述了在激光共聚焦显微镜下添加不同发酵时间甜酒酿的面团超微结构,其中FITC将淀粉颗粒染成绿色,罗丹明B将面筋蛋白染为红色。如图3A所示,空白面团中面筋蛋白以膜状形态存在,结构完整,黑色孔洞少;而淀粉颗粒均匀镶嵌、包裹在面筋网络结构中,起到支撑蛋白网络结构的作用,图中两组分结合均匀且致密,但引入甜酒酿之后,尤其是加入发酵0 h的甜酒酿(图3B),其阻碍了面团中面筋网络的形成,这与甜酒酿对面筋的稀释作用和对二硫键的破坏作用均有关。随着发酵时间的延长,糯米中的蛋白质部分降解,蛋白与淀粉的致密结构得以疏松,有利于气体进入到面团中[21]。当发酵时间延长至48 h时,其面团(图3D)微观结构中的黑色孔洞的面积最小,且相比于其他甜酒酿组,其结构更为完整,淀粉颗粒与蛋白质的更加均匀。但当发酵时间延长至72 h时,蛋白酶酶活性高,面团过度酸化导致小麦面筋降解,阻碍了面筋网络的形成,不利于面团持气[15]。

图3 不同面团的激光共聚焦超微结构图(200×)Fig.3 CLSM images of different doughs(200×)注:不添加发酵酒酿的面团(A),添加发酵0 h(B),24 h(C),48 h(D)和72 h(E)酒酿的面团。第一列为淀粉和面筋网络;第二列为面筋网络;第三列为淀粉;方块代表面筋蛋白,三角形代表孔洞,圆圈代表淀粉颗粒。

小麦面粉中的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白形成的网络结构能够使气体截留[22],糯米粉中醇溶蛋白含量较低,不能形成网状结构,且其淀粉颗粒较小,与蛋白质结合紧密[23],糯米的引入会对小麦面团结构造成不良影响,但通过添加适当发酵时间的酒酿,面团品质得以改善。

2.3 不同发酵时间甜酒酿面包的风味与比容

2.3.1 不同发酵时间甜酒酿对面包风味特性的影响 在面包的制作中,影响面包风味的因素主要有:原料、发酵过程、降解作用和热反应,这四种因素影响面包风味化合物的成分及含量[24-25]。本研究通过GC-MS方法测定了小麦面包和不同发酵时间甜酒酿面包的挥发性风味化合物,其种类、保留时间和相对含量如表1所示,分类统计如图4所示。不同发酵时间的甜酒酿对面包的风味物质的种类和相对含量的影响不同。从表1中可以看出,添加发酵48 h的酒酿所制备的面包的总峰面积最大,且其中具有强烈葡萄玫瑰香气的壬酸乙酯、具有清甜玫瑰样花香的苯乙醇以及具有特殊杏仁香气的苯甲醛均是在发酵48 h酒酿面包中相对含量最大。其中除了添加0 h发酵酒酿的面包外,异戊醇在所有风味物质中所占的相对含量最高,分别为32.68%、30.77%和29.30%。异戊醇具有苹果白兰地香气[26]，阈值较低,仅为250 μg/kg,故其对面包风味的影响很大[27]。从表1中可以明显看出,在添加有酒酿的面包中,苯乙醇相对含量较高,分别为8.86%、12.66%、18.18%和12.01%,虽然其含量不如异戊醇,但其阈值非常低,仅为80 μg/kg[28],故其极易被人类嗅知。

表1 小麦面包和不同发酵时间酒酿面包中挥发性风味物质组成及相对含量Table 1 Composition and relative content of volatile flavor compounds of wheat bread and breadwith fermented glutinous rice with different fermentation time

续表

根据酯类、醇类、酮类、酸类、烃类、醛类以及杂环芳类,将所有的风味化合物进行分类统计。酯类物质一般具有奶油香、花香和果香等令人愉快的味道[6]。但是在0 h的酒酿面包中,乳酸乙酯占酯类相对含量的65.98%,前人的研究中可以发现,乳酸乙酯的嗅觉阈值为128.08 μg/mL,所以较难被人类嗅知[27]。在添加发酵48 h酒酿的面包中,辛酸乙酯是酯类中相对含量最高的,占酯类相对含量的35.53%,且其嗅觉阈值只有0.01287 μg/mL[28],所以添加48 h酒酿的面包其风味更为宜人。

通过图4可以更直观地看出各风味物质在各大类之间的差别。面包中的酵母和甜酒酿中带入的酵母会利用可发酵的糖作为碳源进行发酵,产生大量醇类物质[29]。醇类物质同样会给面包带来宜人的风味,并且大量存在于面包中,各组面包中醇类物质的相对含量分别为20.85%、62.92%、63.41%和60.06%,这是由于酒曲中的酿酒酵母利用糯米发酵,产生大量的醇类物质,同时,酒酿发酵过程中会产生还原糖,有利于面包酵母的生长,这也解释了在添加0 h酒酿的面包中醇类物质含量不如其他发酵组的面包。结合表1和图4的结果可以发现,添加48 h酒酿的面包的挥发性风味物质的含量相对较高,风味也明显优于其他各组。

图4 小麦面包以及不同发酵时间的酒酿面包中挥发性化合物统计Fig.4 Statistics of volatile flavor compounds in wheat bread and breads with fermented glutinous rice with different fermentation time注:不同字母代表同种物质在不同发酵时间相对含量差异显著性(p<0.05)。

2.3.2 不同发酵时间甜酒酿对面包比容的影响 在面包配方中添加不同发酵时间的酒酿制备面包,测定所制得面包的比容,如图5。由图5可知,除添加72 h发酵酒酿组比容较小以外,其他几组面包的比容均没有显著差异(p>0.05)。这说明在发酵过程中产生的少量蛋白酶对糯米的淀粉蛋白网络具有有利的影响,持气能力增强,甜酒酿发酵过程中霉菌水解淀粉产生的还原糖有利于酵母菌的生长,在面包醒发过程中产生更多的气体。但是当添加的甜酒酿发酵时间达到72 h,面包的比容大幅度下降,说明过量的蛋白酶将小麦蛋白水解,使得面筋网络结构遭到破坏,比容大幅度减小。综合而言,添加发酵48 h的酒酿的面包,效果最佳。

图5 含不同发酵时间甜酒酿面包比容Fig.5 Specific volume of bread with fermented glutinous rice of different fermentation time

2.3.3 不同发酵时间甜酒酿对面包感官评分的影响 采用九分嗜好法对添加不同发酵时间的甜酒酿的面包进行感官鉴评,如图6所示。从图6中可以看出,添加24、48 h甜酒酿的面包的外观得分相对较高。在色泽方面,添加48、72 h的甜酒酿的面包得分一样高,这可能是由于甜酒酿发酵时间增加,积累的还原糖的含量不断增多,加剧了烘焙过程中的美拉德反应,使得面包呈金黄色,更为诱人,所以更受欢迎。在风味得分中,同样是添加48 h和72 h的甜酒酿的面包得分较高,随着酒酿发酵时间的延长,得分越高,当发酵至48 h时,感官评分达到最大,这表明随着时间的增加,风味物质不断积累,越来越受到人们的喜爱。总体而言,添加48 h发酵酒酿的面包的质量最好,这也与整体可接受度的分数结果一致。因此,48 h为甜酒酿的最佳发酵时间。

图6 小麦面包及含不同发酵时间甜酒酿面包感官分析Fig.6 Sensory evaluation of bread with fermented glutinous rice of different fermentation time

3 结论

本文研究了不同发酵时间的甜酒酿对面团特性及面包烘焙特性的影响。随着发酵时间的增加,甜酒酿的pH迅速下降,至18 h左右趋于稳定,发酵48 h后,甜酒酿的TTA基本趋于稳定。从酒酿面团的超微结构中可以发现,添加发酵48 h的面团的面筋网络结构较好,少量的蛋白酶有利于减弱无麸质糯米对面团面筋的弱化作用。发酵酒酿的加入使得面包的风味明显提升,尤其是添加发酵48 h酒酿的面包,醇类和酯类物质的含量明显增加,醇类物质相对含量高达63.41%,酯类物质相对含量为8.82%,尤其是辛酸乙酯、壬酸乙酯以及异戊醇,赋予面包更浓郁的花香和果香。除含有72 h酒酿外的面包,比容没有显著性(p>0.05)差异。在感官鉴评中,含48 h酒酿的面包获得最高的分数,成为最受欢迎的面包。本研究为甜酒酿面包的生产提供一定理论依据。