植物乳杆菌和发酵乳杆菌对胡柚汁发酵品质及其抗氧化性的影响

束文秀，吴祖芳，翁佩芳，张 鑫

（宁波大学海洋学院，应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211）

胡柚（Citrus paradisi cv. Changshan Huyou）是柚和橙的天然杂交种，原产于浙江省常山县，现今衢州、龙游等地均有生产[1]。胡柚营养丰富，氨基酸（水解氨基酸和游离氨基酸）种类齐全，富含葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类，VA、VB1、VB2、VC等维生素和Ca、P、K、Mg、Fe和Zn等无机元素[2]，还含有黄酮类化合物、柠檬苦素类物质等功能性组分[3]，具有抗氧化性、抗菌作用、预防肿瘤、治疗呼吸系统疾病和治疗足跟病等生理活性作用[4]。乳酸菌是发酵糖类主要产物为乳酸的革兰染色阳性、无芽孢细菌的总称[5]，具有防治乳糖不耐症、防治腹泻、防治消化性溃疡、抑制致病菌和增强免疫等益生功能[6]。随着人们对健康关注度不断提高，以水果和果蔬等非乳原料的发酵产品越来越受到关注，使其品质及营养价值等的研究具有重要意义。郑欣等[7]研究发现荔枝汁经不同乳酸菌发酵过程中其有机酸和糖类营养物质变化差异显著，多酚和VC变化不显著；魏一星等[8]研究发现小麦胚芽经植物乳杆菌发酵后，能够转化L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸，总游离氨基酸含量显著提高了13.64 倍；果蔬原料经乳酸菌发酵后各种营养成分变化各异。

目前，胡柚多用于鲜食，开发的产品有砂囊罐头、果汁、果酱和果醋等[3]，但利用乳酸菌发酵胡柚汁方面的产品开发研究较少。关于乳酸菌发酵胡柚汁的研究迄今仍集中在发酵工艺，如吴元峰等[9]探讨了胡柚汁乳酸菌发酵脱苦最佳工艺；而对发酵过程中营养品质变化的研究鲜见文献报道。乳酸菌发酵果蔬汁产品是果蔬加工技术的延伸，果蔬汁经乳酸菌发酵后不仅具有原料的风味，还增加了乳酸菌的发酵风味，二者共同构成发酵产品的独特风味，发酵产品还同时具备果蔬汁与乳酸菌的益生功能，丰富了果蔬制品的品种，对果蔬加工新产品具有重要意义。

本研究在前期乳酸菌发酵胡柚汁工艺优化的基础上，选用前期实验筛选的植物乳杆菌和发酵乳杆菌进行发酵，研究胡柚汁经不同乳酸菌发酵后营养和抗氧化特性的变化，以期为胡柚汁乳酸菌发酵产品的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡柚、白砂糖 市售。

植物乳杆菌L1（Lactobacillus plantarum L1）、发酵乳杆菌L2（Lactobacillus fermentum L2）由宁波大学海洋学院食品生物技术实验室保存。

MRS固体培养基、MRS液体培养基 杭州微生物试剂有限公司；甲醇（色谱纯） 杭州化学试剂有限公司；硝酸银 上海化学试剂有限公司；草酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、乙酸、没食子酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、福林-酚 国药集团化学试剂有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

MX-GX1011搅拌机 厦门建松电器有限公司；SPX智能型生化培养箱 宁波江南仪器厂；LDZX-40BI型立式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；5417R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；PHS-3C数字式酸度计上海精密科学仪器有限公司；HH-4数量恒温水浴锅国华电器有限公司；UV-3300型紫外-可见分光光度计上海美普达仪器有限公司；CR-400色差仪 日本Konica Minolta公司；微量进样器（10 μL） 美国安捷伦公司；2695超高效液相色谱仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的处理

挑选新鲜无虫害的胡柚并清洗表面杂质，在90 ℃的水中煮10 min，再将煮过的胡柚去皮，去囊衣，去籽，得胡柚果肉，加水榨汁，经过滤获得胡柚汁；向胡柚汁中添加白砂糖搅拌均匀，在90 ℃条件下灭菌15 min，冷却至25 ℃；将不同乳酸菌发酵菌剂按3%接种后发酵，在37 ℃条件下发酵36 h；然后放置于8 ℃冰箱中静置12 h进行后熟，得到样品。样品分别为对照组（未接菌）、植物乳杆菌L1发酵组、发酵乳杆菌L2发酵组。

1.3.2 乳酸菌生长的测定

采用平板（MRS培养基）计数法测定样品中乳酸菌的生长量。

1.3.3 VC、总酚和黄酮的测定

使用钼蓝比色法[10]测定样品中VC的含量；采用福林-酚比色法[11]测定样品中总酚的含量；采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度法[12]测定样品中黄酮的含量。

1.3.4 有机酸分析

参考林维宣等[13]的方法略有调整。

样品制备：准确称取发酵后的胡柚汁样品2 g，加入8 g水使总质量达到10 g，水浴超声提取10 min，再经12 000 r/min高速离心。取上清液，经过0.22 µm膜过滤，滤液置于1.5 mL进样瓶中待高效液相色谱测定。

色谱条件：采用紫外检测器和C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为3%甲醇-0.01 mol/L KH2PO4缓冲液（1 mol/L磷酸调节pH值至2.8），流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 µL，检测波长210 nm。

1.3.5 样品基本理化指标的测定

采用直接滴定法测定样品的酸度（以总酸质量分数计）；采用pH计测定样品的pH值；使用色差仪测定样品的色差值。

1.3.6 抗氧化性的测定

1.3.6.1 样品的制备

准确称取5 g发酵样品于100 mL容量瓶中，加入10 mL 70%乙醇溶液，超声水浴浸提30 min，提取液6 000 r/min离心10 min。滤液倒入100 mL容量瓶中。滤渣用20 mL 70%乙醇溶液洗进原容量瓶中，摇匀，超声水浴30 min，提取液6 000 r/min离心10 min，倒入上述100 mL容量瓶中。离心液用70%乙醇溶液定容至100 mL即为样液。

1.3.6.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的测定

参考王宏兹等[14]的方法略有修改，分别吸取样液2 mL、0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液2 mL混合均匀，37 ℃避光保存30 min，在517 nm波长处测定吸光度Ai。同上，测得2 mL样液和2 mL无水乙醇的混合液吸光度Aj，2 mL DPPH无水乙醇溶液和2 mL无水乙醇混合液Ac，DPPH自由基清除率按公式（1）计算，实验重复3 次取平均值。

1.3.6.3 超氧阴离子自由基清除能力测定

参考吴祖芳等[15]的方法略有修改，分别吸取Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH 8.2，先置于25 ℃预热20 min）4.5 mL，样液（空白对照组以生理盐水代替样液）4.4 mL，邻苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl溶液配制，调零管用10 mmol/L HCl溶液代替邻苯三酚的HCl溶液）混合均匀，25 ℃水浴反应5 min后加入8 mol/L HCl溶液终止反应，325 nm波长处测量吸光度。超氧阴离子自由基清除率按公式（2）计算，实验重复3 次取平均值。

式中：A样品为样液管的吸光度；A空白为空白管的吸光度。

1.3.6.4 羟自由基清除能力测定

参考马利华[16]的方法略有修改，分别吸取样液（空白管以蒸馏水替代样液）1 mL、9 mmo1/L FeSO4溶液2 mL、9 mmo1/L水杨酸-乙醇溶液2 mL和8.8 mmo1/L H2O2溶液0.2 mL混合均匀，后于37 ℃保温30 min。将蒸馏水取代测试管中的水杨酸-乙醇溶液作为对照组调零，在510 nm波长处测定吸光度。羟自由基清除率按公式（3）计算，实验重复3 次取平均值。

式中：A0为空白管的吸光度；As为样液作为自由基清除剂加入后的吸光度。

1.4 数据处理

数据和图像采用Microsoft Excel处理与分析。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌和发酵乳杆菌在胡柚汁中的生长曲线

图1 植物乳杆菌和发酵乳杆菌在胡柚汁中的生长曲线Fig.1 Growth curves of L. plantarum and L. fermentum in Huyou juice

由图1可以看出，2 种菌在胡柚汁中的生长趋势一致，活菌数都是随着发酵时间的延长先升高后降低，生长趋势与张庆峰等[17]研究中乳酸菌的生长趋势一致。在0～24 h之间，两种菌的活菌数均随时间的延长而升高，0～12 h之间的生长速度较快，在8 h时活菌数均已经突破108CFU/mL，说明这两种乳酸菌在胡柚汁中生长良好，胡柚汁的发酵环境和营养组分适合于这两种菌的生长且具有促进作用。12～24 h之间，活菌数的生长速度逐渐减缓，特别是发酵乳杆菌发酵组在18 h时，活菌数已经基本稳定。24 h之后，活菌数在逐渐减少，这是由于胡柚汁发酵过程中营养组分的变化和环境条件的改变。

2.2 植物乳杆菌和发酵乳杆菌发酵对胡柚汁酸度和pH值的影响

图2 胡柚汁乳酸菌发酵过程pH值和酸度的变化Fig.2 Changes in pH and acidity of Huyou juice during fermentation by lactic acid bacteria

由图2可见，在胡柚汁的发酵过程中pH值呈下降趋势，且前期下降快后期慢；酸度呈上升趋势，且前期上升速度快后期慢，这与李萍[18]研究中变化趋势相近。在发酵初期，pH值迅速降低至3.95，酸度迅速升高到0.7%～0.8%，此阶段两种菌产酸相近，这可能是乳酸菌在对数期生长速度较快，生长代谢旺盛，导致其初期产酸迅速。随着发酵的进行，pH值从3.95～3.8左右下降缓慢，酸度则从0.8%～1%左右缓慢上升，此时两种乳酸菌逐渐经历对数期到稳定期再到衰亡期的过度，故产酸速度逐渐平稳至减少，且6 h后，植物乳杆菌发酵组的pH值一直高于发酵乳杆菌。在发酵42 h之后，pH值和酸度均逐渐趋于稳定，乳酸菌产酸结束。

2.3 色差分析

由图3可知，色差值变化的总体趋势是随着发酵时间的延长，L*值呈下降趋势，a*值、b*值呈上升趋势。L*值反映样品的亮度，在0～24 h内，L*值下降明显，24～48 h之间L*值基本趋于稳定，符合乳酸菌在胡柚汁中生长规律，说明乳酸菌发酵能够降低胡柚汁的亮度，可能是乳酸菌发酵产生的代谢产物会使胡柚汁的黏稠度轻微增加，从而影响了亮度。a*值反映样品的红绿色，0～24 h内显著增加，24～48 h内稳定，与生长规律相符，说明乳酸菌接种发酵对胡柚汁的红色有加强作用。b*值反映样品的黄蓝度，变化趋势与a*相似，b*值一直是表示黄色的正值且数值在0～1.8之间，这与胡柚原料本身的淡黄色有关，而乳酸菌发酵后黄色得到了轻微加强，肉眼看并不明显。ΔE*值代表样品的色差综合偏差值，增幅在0～3之间，变化趋势并不大，有研究[19]发现当ΔE*值不小于2时人眼可以感觉到视觉的差异，而2种样品的ΔE*值与2相近，所以肉眼观察2种样品的色泽的差异并不明显，有轻微不同。

图3 胡柚汁乳酸菌发酵过程色差值的变化Fig.3 Changes in color of Huyou juice during fermentation by lactic acid bacteria

2.4 有机酸分析

通过高效液相色谱检测两种乳酸菌对胡柚汁中有机酸的代谢情况，结果如表1和图4所示。由表1可以看出，乳酸菌发酵对胡柚汁中有机酸含量影响较大，且因菌株不同而有所差异。酒石酸、柠檬酸、乙酸和乳酸的含量均显著提高，其中植物乳杆菌发酵组酒石酸和柠檬酸含量高于发酵乳杆菌；草酸、苹果酸和琥珀酸含量下降显著，苹果酸含量下降最为明显，且发酵乳杆菌发酵后的苹果酸含量低于植物乳杆菌。

表1 乳酸菌发酵后胡柚汁有机酸质量浓度变化Table1 Changes in organic acid content of Huyou juice fermented by lactic acid bacteria mg/mL

图4 胡柚汁乳酸菌发酵后有机酸的变化Fig.4 Changes in organic acid proportions of Huyou juice fermented by lactic acid bacteria

有机酸含量是乳酸菌发酵果蔬汁发酵终点的指标之一，对乳酸菌发酵果蔬汁产品的营养和风味影响很大[20]。由表1和图4可以看出，胡柚汁经乳酸菌发酵后，变化较大的是草酸、苹果酸、乳酸和乙酸。乳酸和乙酸占总的有机酸量由原来的20%和5%分别上升到55%和25%，草酸和苹果酸由原来的30%和20%降低到不足2%。发酵后胡柚汁中有机酸的组成及比例均有所变化，构成了乳酸菌发酵胡柚汁独特的风味。苹果酸能被乳酸杆菌属中的菌株代谢成乳酸，此途径一般为MLF途径[21]。发酵乳杆菌是异型发酵乳酸菌，能够将胡柚汁中糖类和有机酸转化为乳酸菌的特征产物乳酸和乙酸等有机酸。植物乳杆菌属于同型发酵乳酸菌，理论上此类乳酸菌发酵产物较单一，产生乳酸，但本实验中接种植物乳杆菌的样品中乙酸含量也有增加，可见还有更为复杂的发酵体系。林晓姿等[22]研究发现植物乳杆菌发酵也可产生乙酸，主要过程分为两步：发酵前期先以苹果酸（MLF途径）为底物产生乳酸；随着发酵的进行，MLF途径结束后，植物乳杆菌再进行异型乳酸发酵，将糖等代谢为乳酸和乙酸。

2.5 VC分析

由图5可以看出，VC在不同菌株发酵的胡柚汁中变化趋势一致，都是随着发酵时间的延长而增加，但从数量级上看变化趋势其实不大。在0～12 h之间，VC含量增长速度较快，迅速从0.27 mg/mL增至0.3 mg/mL，增长量为0.03 mg/mL；12 h后，增长速度稍微减少，减少到每12 h 0.02 mg/mL左右。0～36 h之间，植物乳杆菌发酵组的VC含量逐渐高于发酵乳杆菌，此时可能是植物乳杆菌产生VC的速度快于发酵乳杆菌；36 h后，发酵乳杆菌高于植物乳杆菌，这与2 种菌生长代谢过程中复杂反应有关，具体原因还需进一步的实验分析。仲山民等[23]研究发现胡柚本身的酸性环境能保存和积累VC，所以在乳酸菌发酵胡柚汁过程中短时间内VC的含量有轻微的增加。

图5 胡柚汁乳酸菌发酵过程中VC含量的变化Fig.5 Changes in VC content of Huyou juice during fermentation by lactic acid bacteria

2.6 总酚和总黄酮分析

图6 胡柚汁发酵后总酚和总黄酮含量的变化Fig.6 Changes in total phenol and total flavonoids contents of Huyou juice fermented by lactic acid bacteria

由图6可见，胡柚汁经乳酸菌发酵后总酚含量提高，植物乳杆菌发酵组的总酚含量高于发酵乳杆菌，此结果与Cagno等[24]研究结果一致，酚类物质有游离态和结合两种形式，结合态又分为不可溶性共价结合酚和可溶性共价结合酚[25]，可溶性共价结合酚可与长链脂肪酸、长链醇类等物质相连[26]，乳酸菌发酵时会产生多种酶作用于底物，可能导致胡柚汁中可溶性结合酚释放，从而造成总酚含量的上升。不同乳酸菌发酵样品总酚含量变化的差异与菌株产生特定酶的含量和活性等有关。

接种乳酸菌发酵后，总黄酮含量均提高，而发酵乳杆菌发酵组的总黄酮含量高于植物乳杆菌，胡柚汁原汁所含总黄酮较少，但发酵后总黄酮量提高，这与Talcott等[27]研究结果相近。赖婷等[28]研究发现植物乳杆菌发酵能释放结合态黄酮为游离态黄酮，使得总黄酮含量增加，这可能是本研究黄酮类化合物总含量增加的原因之一，具体变化原因包含酶系与黄酮本身不稳定性的复杂作用。

2.7 体外抗氧化性分析

图7 胡柚汁乳酸菌发酵3 种自由基清除率变化Fig.7 Changes in free radical scavenging capacity of Huyou juice during fermentation by lactic acid bacteria

由图7可见，植物乳杆菌和发酵乳杆菌发酵组样品对DPPH自由基清除能力分别提高了6.9%和4.3%，每组的变化趋势为先增加后降低，在12 h时清除率最高，24 h后植物乳杆菌发酵组高于发酵乳杆菌；对于超氧阴离子自由基清除能力，植物乳杆菌发酵组和发酵乳杆菌与未发酵时相比，分别提高了15.9%和18.5%，3种样品均随着发酵时间的延长而稳定提高，24 h后发酵乳杆菌高于植物乳杆菌；对于羟自由基清除能力，植物乳杆菌和发酵乳杆菌分别提高了4.8%和0.7%，变化趋势与DPPH自由基相同，12 h后，随着发酵时间的延长清除率逐渐降低且植物乳杆菌逐渐高于发酵乳杆菌。综上，胡柚汁经2 种乳酸菌发酵后，对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力均显著提高。

自由基是化合物在外界因素影响下，共价键断裂而形成具有不成对电子的分子或基团，具有强氧化性，能损伤细胞从未发衰老和各种疾病的发生[29]。研究[30]发现果蔬中的酚类、黄酮类化合物和VC等对自由基有清除作用。酚类和黄酮类化合物[30]等物质能螯合机体内金属离子，抑制产自由基酶活性。赖婷等[28]研究发现桂圆肉接种乳酸菌后，总黄酮类和游离态酚类物质含量增加，同时提高了抗氧化能力。王宏兹等[14]研究发现植物乳杆菌发酵紫薯粉面包的总酚含量分别增加了90.8%和6.1%。本研究中植物乳杆菌和发酵乳杆菌分别接种胡柚汁后，发酵胡柚汁中总酚、黄酮类化合物和VC都有提高，相对应的3 种自由基清除率也有提高，研究结果与文献一致。

3 结 论

植物乳杆菌L1和发酵乳杆菌L2在胡柚汁中生长良好，活菌数突破108CFU/mL，产酸迅速。胡柚汁经植物乳杆菌和发酵乳杆菌发酵后，色泽值（L*值、a*值、b*值和ΔE*值）差异不明显，色泽微有不同。有机酸含量变化显著，其中酒石酸、柠檬酸、乙酸和乳酸的含量均显著提高，草酸、苹果酸和琥珀酸的含量显著下降，且因菌株不同差异显著。

胡柚汁发酵过程中，植物乳杆菌和发酵乳杆菌生长旺盛，经乳酸菌发酵后胡柚汁中VC、总酚和黄酮类化合物含量提高，其相应的发酵胡柚汁的自由基清除能力提高，表明胡柚汁经乳酸菌发酵后能提高抗氧化能力，其具体机理还需进一步的研究。