基于多重修饰酶电极技术检测大豆油中磷脂含量

王立琦，刘雨琪，陈颖淑，王 雯，王睿智，刘亚楠，张 欣，隋玉林,，于殿宇,

（1.哈尔滨商业大学计算机与信息工程学院，黑龙江 哈尔滨 150028；2.黑龙江省电子商务与信息处理重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150028；3.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；4.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

脱胶是大豆油精炼过程中的重要环节，目的是将大豆毛油中的磷脂等胶质脱掉，是后续脱色和脱臭的基础，因此在油脂加工过程中需要不断检测大豆油中磷脂含量。传统的检测方法是进行化学分析，检测速度慢、成本高、受人为因素和实验环境影响大、易污染环境，更不利于在线检测和调控[1-3]。大豆毛油中磷脂的含量高，其中卵磷脂占主要组成部分。

磷脂的传统检测方法包括红外吸收光谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法[4]、薄层色谱法、核磁共振氢谱法[5]、色谱-质谱联用法[6]等。但这些检测方法存在成本高、操作复杂、分析速度慢、难以快速实时检测等特点。因此检测大豆毛油中的磷脂先从单一的卵磷脂入手，并逐步应用到含有多组分的大豆毛油中。

而电化学分析技术具有快速、准确、易于实现在线检测等优点[7-8]，近年来在食品安全领域得到广泛应用。丝网印刷电极是一种一次性电极，具有制作简单、成本低廉、灵敏度高、响应速度快、便于携带等特点[9]。方便对市场上各种分析物进行可重复的和一次性的现场检测[10]。丝网印刷电极生物传感器能够弥补传统气相色谱-质谱方法检测费用高、速度慢等不足，常用于农产品中的农药残留检测[11-13]，在食品的快速检测中也具有诸多优点，因而广泛用于食品卫生安全性的检测[14]。Li Shuguo等[15]制备了聚吡咯修饰电极的电化学传感器，利用线性电位伏安法检测植物油中酸价的含量，与传统滴定法相比，该检测方法灵敏度、准确度高，需要少量的植物油样品，无需预处理。Hsu等[16]制备了固定酶修饰印刷丝网电极的电化学传感器，实现对甘油二脂的测定，检测灵敏度高；Robledo等[17]采用电化学方法结合人工神经网络测定食用植物油中生育酚同系物的含量，结果显示，食用油中生育酚含量实测值和生产商标注VE含量基本一致；王丽然等[18]采用壳聚糖为固定化材料，制备了有机相辣根过氧化物酶传感器，经循环伏安法实现了对植物油中过氧化值含量的测定，检测结果优于国标碘量法，并且检测时间短、准确度较高；郭敬轩等[19]利用多孔碳修饰玻碳电极并通过循环伏安法检测油脂中抗氧化剂丁基羟基茴香醚的含量；刘晓伟等[20]基于电化学方法，建立了电流型酶传感器，实现了对花生油中黄曲霉素B1的快速检测。

目前，国内外鲜有关于磷脂电化学方法检测的报道，本研究参考磷脂的性质和油脂中其他物质的检测方法，采用丝网印刷电极，以四氧化三铁-壳聚糖纳米复合物，然后用交联剂将辣根过氧化物酶和胆碱氧化酶依次交联到修饰丝网印刷电极表面，制备多重修饰酶电极。构建一种酶电极，通过电化学方法间接或直接检测分析磷脂的含量，具有广泛的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

一级大豆油 九三粮油工业集团有限公司；磷脂酶D（168 U/mg）、胆碱氧化酶（18 U/mg）、辣根过氧化物酶（265 U/mg）、磷脂酰胆碱（99%） 美国Sigma公司；纳米四氧化三铁 汕头市西陇化工厂有限公司。

1.2 仪器与设备

CHI660D电化学工作站 上海辰华仪器公司；EI3002丝网印刷电极 南京中科电极有限公司；MATLAB R2015a（Math Works）、Unscrambler X10.3挪威CAMO公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

以一级大豆油为基料，通过添加一定量的大豆粉末磷脂、磷脂酶D（10 U/mL）及1%的Triton-X100作为乳化剂，制备出40 个磷脂含量不同的混合大豆油样品，并采用国标法（钼蓝比色法）测量样品中磷脂含量标准值。

1.3.2 多重修饰酶电极的制备

由于磷脂酶D酶解磷脂生成磷脂酸和胆碱过程中不产生电子转移，针对此问题本实验研制多重修饰酶电极传感器，制备四氧化三铁-壳聚糖纳米复合物，利用乙酸添加四氧化三铁纳米粉，超声处理分散60 min，最后获得一种均一稳定的黑色悬浮液。所获得的高度分散黑色悬浮液为四氧化三铁-壳聚糖纳米复合物，将其均匀涂于经预处理的丝网印刷电极表面，获得四氧化三铁-壳聚糖修饰电极，然后将2.5 μL酶活力为0.8 U/μL的辣根过氧化物酶溶液和2.5 μL 1.2 U/μL的胆碱氧化酶溶液分别通过戊二醛交联固定在修饰电极上，制得多重修饰酶电极传感器，组装过程见图1。

图1 多重修饰酶电极的组装过程Fig.1 Assembling of multiple modified enzyme electrodes

1.3.3 电化学数据采集

多重修饰酶电极使磷脂酶解副产物胆碱继续氧化产生过氧化氢，再对酶解副产物过氧化氢进一步酶解，使本不产生电子转移的酶解过程，通过对其酶解副产物逐步酶解，间接产生电子转移并转化成电信号，然后将多重修饰酶电极与电化学工作站连接，采用循环伏安法扫描，电位扫描范围为－0.6～0.8 V，扫描速率为0.01 V/s[21]。

1.4 数据处理

首先，对采集的原始电化学数据分别利用Savitzky-Golay平滑滤波和dbN系列小波进行去噪处理，然后再分别利用还原峰电流与磷脂含量直线拟合、主成分回归、偏最小二乘回归和支持向量机回归4 种方法建立校正回归模型。

2 结果与分析

2.1 磷脂循环伏安曲线

图2 磷脂的循环伏安曲线Fig.2 Cyclic voltammograms of phospholipids at different concentrations

如图2所示，磷脂质量浓度为5.87～304.89 mg/L，随着磷脂质量浓度的增加，大豆油样品的循环伏安曲线的还原峰电流越小，在磷脂质量浓度为5.87～304.89 mg/L范围内，还原峰电流大小与磷脂的质量浓度呈现良好的线性关系。

2.2 电化学数据预处理

由于人工操作失误、仪器异常、环境（如温度、湿度等因素的变化）或者样品本身等原因[22]，测定样品时经常会出现个别异常样本，这些异常样本不能用于模型的建立，需将其剔除。本实验基于原始电化学数据建立了偏最小二乘校正模型，根据预测值与实际值的偏差剔除异常样本2 个，为提高模型预测精度，再分别利用Savitzky-Golay平滑滤波和dbN系列小波对原始电化学数据进行去噪处理。

2.2.1 平滑去噪

Savitzky-Golay法最突出的优点是它能够有效地保留数据的原始特征，其本质就是利用窗口内部各个点之间的加权来计算平滑后的新值，关键在于如何选择多项式次数和窗口点数，选择不同的组合，结果也会不同[23]。本实验选取窗函数大小为5～15 点之间的奇数，多项式次数为2、3、4、5进行验证，并通过平滑降噪后的均方误差、信噪比、数据能量占原始能量的比例和平滑度来评价去噪的效果。窗函数较大可以提高信噪比，但难免会导致信号失真，经分析对比平滑去噪效果可知，窗函数大小为13 点、多项式次数为2时，平滑处理去噪效果最好，其均方误差为0.041 685，信噪比为28.26，数据能量占原始能量的比例为0.989 4，平滑度为0.409 61。为获得电化学数据降噪处理的最佳效果，本实验再采用小波去噪法对电化学数据进行降噪处理。

2.2.2 小波去噪

采用Daubechies小波对电化学数据进行多尺度小波分解以达到消除噪声的目的。Daubechies小波一般简写成dbN，N是小波的阶数，Daubechies小波基是一个小波族[24]，db1～db10有10 个小波基，如何选择最适合的小波基，目前的研究报道中鲜见有较好的方法，只能通过反复实验进行筛选。本实验中样本长度为282，db9、db10最大分解尺度3，为方便分析比较，将其他小波基的分解尺度也设定为3，阈值方式选择基于Stein无偏似然估计的软阈值估计，以不同小波基对电化学数据进行去噪，并获得了不同小波基函数去噪后的均方误差、信噪比、去噪信号在原信号中的能量比例和平滑度，经分析比较可知，db6小波基函数时，平滑度最小为0.086 19，去噪效果最好，并且其均方误差较小为0.011 37，信噪比较大为30.21，去噪信号在原信号中的能量比例为0.999 8。

信号的小波分解需根据信号长度确定最大分解层数，本实验中校正集样本长度为282，最大分解尺度为4，表明本实验的电化学数据在去噪中的分解尺度可为2、3或4。对于多少尺度分解能达到最佳效果，还要通过实验的方法确定，将db6小波基在不同分解尺度和4 种阈值方式下分别对电化学数据进行降噪处理，经综合比较分析去噪结果发现db6经3尺度分解去噪效果较好，且4 种阈值方式中基于Stein无偏似然估计的软阈值估计方式去噪的均方误差为0.010 77，信噪比为30.21，去噪信号在原信号中的能量比例为0.999 8，平滑度为0.086 19，去噪效果最佳。

综合以上研究结果，将基于Stein无偏似然估计的软阈值估计方式的db6小波基对大豆油脂的电化学伏安曲线数据进行三层小波分解去噪处理与Savitzky-Golay平滑处理最佳效果进行分析对比，经小波去噪和平滑处理后的伏安曲线降噪效果对比见表1。经表1对比分析，整体来看小波去噪效果明显优于Savitzky-Golay平滑处理，因此本实验采用小波去噪方法对原始电化学数据进行处理。

表1 经小波去噪和平滑处理后的伏安曲线降噪效果对比Table1 Comparison of noise reduction of voltammograms by Savitzky-Golay smoothing filter and db6 wavelet three-layer decomposition

2.3 校正模型的建立

为构建可靠、稳定的分析校正模型，分别采用4 种方法建立去噪后的电化学数据与磷脂质量浓度之间的回归模型，首先利用还原峰电流与磷脂含量之间进行直线拟合，再采用主成分回归[25]、偏最小二乘回归[26]和支持向量机回归[27]建立校正回归模型，并采用决定系数R2、预测均方根误差和相对标准偏差3 种评价指标来衡量模型预测效果，通过分析对比4 种方法的建模效果，以期寻找出最佳磷脂含量检测模型。

2.3.1 峰电流与磷脂质量浓度的线性拟合

多重修饰酶电极在不同质量浓度的磷脂溶液中经扫描得到其电流-电位循环伏安曲线，为明确循环伏安曲线的峰电流与磷脂质量浓度的关系，首先提取曲线的峰值，借助还原峰电流与磷脂质量浓度化学值之间进行简单的单变量线性拟合。

图3 还原峰电流与磷脂质量浓度关系图Fig.3 Relationship between reduction peak current and phospholipid concentration

将提取还原峰电流与磷脂质量浓度化学值进行简单的线性拟合，如图3所示。随着磷脂质量浓度的增加，还原峰电流不断减小，其线性回归方程为ipc＝－1.02lgC+4.341，磷脂质量浓度在5.87～304.89 mg/L范围内呈现良好的线性关系，检出限为1.68 mg/L（RSN=3）。其决定系数R2为0.987 6，预测均方根误差为0.557 1，相对标准偏差为4.93%。

2.3.2 回归校正模型

由于循环伏安曲线的峰电流易受仪器或其他环境因素的影响而产生波动，实际和提取的峰电流可能存在一定的偏差[28]，所以简单的单变量线性拟合模型对磷脂质量浓度的预测并不一定能够满足实际检测要求。为建立更高精度的预测模型，再利用主成分回归、偏最小二乘回归及支持向量机回归在电化学数据与磷脂质量浓度标准值之间建立回归校正模型，以期寻找最佳的磷脂检测模型。

首先对数据进行样本分集，将38 个样品按磷脂含量的多少进行排序，按照一定梯度变化从中选取28 组作为训练集样本，用于建立模型，剩下的10 组数据作为预测集样本，用于验证模型的适用性，训练集样品和预测样品集的磷脂含量平均值应尽量接近，并且训练集包含样品中的最大值和最小值，样本校正集和预测集统计结果见表2。

表2 样本校正集和预测集统计结果Table2 Statistical analysis of calibration and prediction sets

利用美国MathWorks公司的Matlab R2015a数据分析软件中的主成分回归算法[29]、偏最小二乘回归算法及Unscrambler软件中的支持向量机回归算法[30]并采用4 种核函数即线性核函数、多项式核函数、径向基核函数和神经元的非线性作用函数核函数对大豆油中磷脂含量的化学值和电化学数据建立回归校正模型，然后将预测结果与实际值进行对比，分析计算其误差。经研究，基于神经元的非线性作用函数核函数的支持向量机回归建模效果很差，所以之后将不再进行讨论，建模效果评价指标对比见表3。

表3 建模效果评价指标对比Table3 Comparison of prediction performances of regression models

由表3可以看出，主成分回归模型建立效果比直线拟合差，偏最小二乘回归及支持向量机回归模型建立效果均优于直线拟合模型。经分析比较可知，基于径向基核函数支持向量机回归方法建立回归校正模型对未知样品的预测效果最佳，支持向量机回归（径向基核函数）的回归预测模型如图4所示。

图4 支持向量机回归（径向基核函数）回归预测模型Fig.4 SVMR prediction model (based on radial basis function)

基于径向基核函数的支持向量机回归对电化学数据与磷脂含量标准值建立的回归校正模型对未知样品预测效果最佳，样本均分布在拟合线附近，其模型的决定系数R2为0.998 7，预测均方根误差为0.288 9，相对标准偏差为2.55%，可以满足实际检测要求。

3 结 论

利用多重修饰的酶电极采集不同磷脂含量的大豆油样本的电化学循环伏安曲线，通过去噪处理使循环伏安曲线的还原峰电流与大豆油中的磷脂含量进行直线拟合。再分别利用主成分回归、偏最小二乘回归和支持向量机回归4 种方法根据其对应的标准化学值建立回归预测模型，研究发现基于径向基核函数的支持向量机回归模型预测效果最佳，统计指标均达到预期效果，满足实际检测要求。本研究可为实现油脂中磷脂实时有效的在线检测提供理论依据。