沙门氏菌重组酶聚合酶检测方法的建立及应用

刘立兵，耿云云，姜彦芬，刘思颖，孙晓霞，南汇珠，王建昌,

（1.河北出入境检验检疫局技术中心，河北 石家庄 050051；2.河北省检验检疫科学技术研究院，河北 石家庄 050051；3.河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050024）

沙门氏菌（Salmonella）属于肠道菌科细菌，兼性厌氧菌[1]，是一种能够导致人畜共患病的革兰氏阴性杆菌。在世界各国都属于常见的食源性致病菌，在细菌性食物中毒种类中，沙门氏菌引起的食物中毒事件常被列榜首[2-3]。沙门氏菌主要通过人和动物的消化道感染致病，潜伏期通常在4～8 h，引起呕吐、发热、腹泻等症状，在从而引起食物中毒、慢性肠炎等疾病；在中国，由沙门氏菌导致食物中毒事件占全国食物中毒事件的40%～60%[4]；在欧洲每年有16万多人感染沙门氏菌，发病率约为0.035%[5]；动物饲用了含有沙门氏菌的饲料，会引起鸡白痢、猪霍乱等相应的疾病，最终导致动物死亡[6]。因此，沙门氏菌一直是国内外细菌学领域研究的重点。

沙门氏菌广泛存在于自然界，在常温条件下就可繁殖生长，而且对营养条件的要求很低，在肉类、禽类、蔬菜，蛋类、豆制品中都检测到沙门氏菌[7-8]，其中生肉是沙门氏菌污染的主要食品[9]。目前，沙门氏菌的鉴定方法主要采用传统的检测方法[10]，分离培养和VITEK全自动鉴定系统，该方法检测周期长，过程费时费力，而且菌落形态受样品复杂程度影响较大，肠杆菌科细菌间的生化反应多有交叉，在检测特异性和敏感性方面有局限性[11]。随着分子生物学技术的发展，沙门氏菌的检测方法也出现了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法[7,12]、实时荧光PCR法[13]、环介导等温扩增法[14]，这些方法在快速检测和现场检测方面有一定的局限性。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种新型的等温扩增技术。该技术主要通过重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，在双链DNA中定位同源序列，发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。

沙门氏菌的表面有很多外膜蛋白，这些蛋白与细菌进入宿主上皮细胞的能力密切相关。有研究表明，沙门氏菌表面的侵袭蛋白（invasion protein，inv）起到关键性作用[15]。侵袭蛋白是由invA、invB、invC、invD和invE等基因编码组成，invA为沙门氏菌的主要毒力因子，在沙门氏菌的致病过程中起到重要作用[15-16]，基于invA基因设计的引物鉴定沙门氏菌，具有属特异性[17]。本研究以invA基因序列为靶序列，设计特异性RPA引物，建立能够快速有效检测沙门氏菌的RPA等温检测方法。

本研究建立的RPA等温检测方法操作简单、反应快速，能够排除人为干扰、交叉污染等不可控因素对沙门氏菌检测的影响；该方法对仪器设备要求低，不需要大型的仪器设备，适合于偏远不发达地区的实验室对沙门氏菌的检测。同时，也为食源性致病的鉴定和检测提供了一个新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本实验所用的菌株见表1。

表1 实验用菌株信息Table1 Information about the strains used in this study

1.1.2 材料与试剂

蔬菜、禽类中都能检测到沙门氏菌，而且生肉是沙门氏菌污染的主要食品[7-9]，选取生活中常食用的鸡肉、羊肉和西兰花做为模拟样品，由本实验室提供。

Premix Ex Taq 宝生物工程（大连）有限公司；RAA试剂盒（基础型） 浙江泰晶生物科技有限公司；DNA纯化回收试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；缓冲蛋白胨水（BPW）、沙门氏菌显色培养基、营养肉汤 北京陆桥技术有限责任公司；引物及探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 仪器与设备

ABI 7500实时荧光PCR仪 美国ABI公司；DK-8D电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；NanoDrop 2000c核酸分析仪 美国Thermal公司；Fusion Fx5凝胶成像系统 法国Viber Lourmat公司；MIR253恒温培养箱日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

以沙门氏菌invA为靶基因，参考GeneBank上序列进行比对，确定保守序列。设计RPA特异性引物，目的片段大小为200 bp，同时参照文献[18]合成沙门氏菌实时荧光PCR的引物和探针。所有引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。

表2 引物探针序列Table2 Primers and TaqMan probe sequences

1.2.2 沙门氏菌的培养及基因组DNA提取

将沙门氏菌（CICC22956）菌株接种到10 mL的营养肉汤中，恒温培养箱37 ℃培养18 h，取菌液进行斜面划线接种至沙门氏菌显色培养基中，37 ℃恒温培养箱培养18 h，传代培养2 次，出现单菌落。

取沙门氏菌纯培养菌液1 mL加入到1.5 mL的离心管中，10 000 r/min 离心2 min，收集沉淀，将菌体沉淀按照细菌基因组DNA提取试剂盒所述方法提取细菌DNA，立即使用或－20 ℃保存备用。同时使用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测定浓度。

1.2.3 RPA方法的建立

使用R A A试剂盒（基础型）配制单个反应体系，其中10 μmol/L的RPA-F和RPA-R各2 μL，A Buffer 12.5 μL，模板1 μL，ddH2O 30 μL。将上述47.5 μL体系混匀后加入到装有冻干酶制剂的反应管中，用移液器上下吹打至完全溶解，向反应管中加入2.5 μL B Buffer（280 mmol/L醋酸镁），盖紧后瞬时离心并涡旋后，放入38 ℃水浴锅中反应10、20、30 min和40 min。使用DNA纯化试剂盒对RPA产物进行纯化，取5 μL产物进行2%琼脂糖凝胶电泳并在Fusion Fx5中观察分析电泳结果。

1.2.4 实时PCR方法

按照文献[18]配制沙门氏菌实时PCR体系。反应体系：Premix Ex Taq 12.5 μL，10 μmol/L PCR-F和PCR-R各2 μL（终浓度为0.8 μmol/L)，5 μmol/L PCR-Probe 0.9 μL（终浓度为0.18 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O 6.6 μL。将上述体系充分混匀后放入ABI7500实时荧光PCR仪中，反应程序设置为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸35 s，35 个循环，60 ℃收集荧光信号。

1.2.5 特异性和灵敏性实验

根据1.2.3节建立的最佳反应时间，以表1中所示菌株的DNA作为模板进行RPA反应，确定RPA反应的特异性。

取1 mL纯培养菌液提取的基因组DNA，进行10 倍梯度稀释，以1 µL为模板进行RPA反应，确定该方法的灵敏性。同时与已建立的实时PCR方法的敏感性作比较。

1.2.6 人工模拟污染样品检测

挑取培养的沙门氏菌单菌落于1 mL灭菌的生理盐水试管中，振荡混匀30 s，麦氏浊度仪测定1.00 个麦氏浊度，用生理盐水进行10 倍梯度稀释，选取10－5、10－6、10－7稀释度的菌液200 μL涂于沙门氏菌显色培养基上，并作3 个平行，用于计算纯培养菌的初始浓度。

取羊肉、鸡肉和西兰花样品，经GB 4789.4—2010《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》验证3 份样品沙门氏菌均为阴性，作为人工污染的样品，进行检出限分析。选择1～10、10～50、50～100 CFU范围内细菌分别添加到25 g羊肉、25 g鸡肉和25 g西兰花样品中，再添加到225 mL沙门氏菌增菌肉汤中，37 ℃培养，增菌6、8 h后分别取1 mL菌液参照1.2.2节进行细菌DNA的提取，取1 μL作为模板进行检测。

1.3 数据分析

采用1.2.3节建立的RPA方法和1.2.4节实时PCR方法，同时检测1.2.6节人工模拟污染样品的核酸，通过对RPA片段和实时PCR扩增曲线的分析，完成对不同样品、不同污染量和不同增菌时间的人工模拟污染样品的检测。

2 结果与分析

2.1 RPA反应时间的优化

以1 mL菌液提取的DNA为模板，进行RPA最佳反应时间实验，在200 bp处有一条特异性条带（图1），通过Bio1D软件定量分析，划定相同面积的扩增条带，进行产物量对比分析，20 min RPA产物量接近10 min产物量的2 倍，而20 min产物量与30 min和40 min的产物量没有显著差异，所以本研究RPA的最佳反应时间确定为20 min。

图1 沙门氏菌RPA检测时间优化结果Fig.1 Optimization of RPA reaction time for Salmonella detection

2.2 特异性实验结果

以沙门氏菌及表1中其他26 种食源性致病菌基因组DNA作为模板，进行RPA反应，结果表明，只有沙门氏菌出现特异性扩增条带，其他细菌均在200 bp处无扩增条带，说明该方法具有良好的特异性，具体结果如图2和表1所示。

图2 沙门氏菌RPA检测特异性结果Fig.2 Specificity of RPA for Salmonella detection

2.3 灵敏性实验结果

提取1 mL沙门氏菌菌液的核酸，经核酸分析仪测定质量浓度为1.1×102ng/μL，将核酸进行倍比稀释至1.1×10－4ng/μL，分别进行RPA反应和实时PCR。结果表明，RPA反应当质量浓度为1.1×10－3ng/μL时有扩增条带，当质量浓度为1.1×10－4ng/μL时，无任何扩增条带，由此确定RPA反应的最低检测限为1.1×10－3ng/μL； 实时PCR在质量浓度为1.1×10－3ng/μL时检测结果Ct值在31，当质量浓度为1.1×10－4ng/μL时检测结果Ct值为35，无扩增曲线。由此可见，RPA反应和实时PCR的最低检测限一致，都为1.1×10－3ng/μL（图3）。

图3 沙门氏菌RPA和实时荧光PCR检测方法的敏感性实验结果Fig.3 Sensitivities of RPA and real-time PCR for Salmonella detection

2.4 人工模拟污染样品检测结果

人工污染沙门氏菌的羊肉、鸡肉和西兰花样品增菌后，RPA检测结果表明，当样品污染量为4 CUF/25 g，接种时间为6 h，羊肉、鸡肉和西兰花均未检出沙门氏菌，而当接种时间为8 h时，样品均检出沙门氏菌；当样品污染量为14 CFU/25 g，接种时间为6、8 h，羊肉、鸡肉和西兰花均检出沙门氏菌；当样品接种量为59 CFU/25 g，接种时间为6、8 h，所有样品均检出沙门氏菌。所有样品与实时荧光PCR检测结果一致，见表3。

表3 人工污染样品RPA检测结果Table3 Detection of RPA in artificially contaminated samples

3 讨 论

在我国，每年都会发生食源性致病菌中毒事件，沙门氏菌是引起人和动物食物中毒的重要感染源，沙门氏菌的检测在食源性致病菌的检测中处于非常重要的位置。目前，沙门氏菌的检测普遍采用传统的检测方法，检测周期在4～6 d之间，检测周期长，操作复杂，需要经验丰富的检测人员，这些都不足以满足市场的需求。近几年，沙门氏菌的检测也建立了很多分子生物学的方法，如，武晓松等[7]建立了沙门氏菌PCR检测方法，并应用到蔬菜中沙门氏菌的检测；杜雄伟等[13]建立了实时荧光PCR检测肉制品中的沙门氏菌的方法；高琳等[14]建立了交叉引物等温扩增法和环介导等温扩增检测沙门氏菌的方法。但在食源性致病菌的检测方面，由于食品的成分复杂、食品中添加剂及培养基的成分复杂，都会对反应的Taq酶的活性起到一定的抑制作用，影响反应的扩增效率。Jacobsen等[19]研究表明，荧光定量PCR不能有效区分死菌和活菌，所以荧光定量PCR方法不适用于检测加热致死的菌体的样品；其次，这些检测方法都需要昂贵的检测仪器和专业的操作人员，且在快速检测、现场检测以及市场需求方面有一定的局限性。所以建立快速、精准、满足市场需求的检测方法，对我国沙门氏菌的检测非常重要。

RPA作为一种新型的快速检测技术，已经应用到各个领域。在病毒检测方面，Wang Jianchang等[20]建立了猪圆环2型病毒的RPA快速检测方法，并应用到临床样品的检测；在转基因方面，邓婷婷等[21]应用RPA检测转基因水稻中的Cry1Ab/c基因；在真菌方面，Ahmed等[22]应用RPA技术检测致病性钩端螺旋体（pathogenic Leptospira）；在细菌方面，Euler等[23]应用RPA技术检测兔热病杆菌（Francisella tularensis）。在寄生虫[24-26]、食品安全[27]、生物安全[28]和癌症[29]等方面RPA技术都已经有研究。RPA是一种等温扩增技术，具有试剂易于保存、反应时间较短、操作简单等优点，并且对仪器设备要求较低，在水浴锅、保温杯，甚至手中即可进行反应[30]，适合于食源性致病菌的检测，也便于推广到仪器设备比较匮乏的基层检测机构。

沙门氏菌invA基因具有属特异性，常作为沙门氏菌研究的靶基因，如Radhika等[31]根据invA基因设计了特异性检测致病性沙门氏菌的引物，并在非沙门氏菌中没有检测到invA基因；庞心怡等[32]根据invA基因建立的LAMP检测方法，比PCR方法的灵敏度高100 倍；魏琼[33]根据沙门氏菌的invA基因，建立了沙门氏菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的三重荧光定量PCR。本实验选择invA基因作为沙门氏菌检测的靶基因，设计特异性引物，建立了沙门氏菌的RPA检测方法，即38 ℃水浴锅反应20 min完成检测，特异性强，灵敏性达到1.1×10－3ng/μL。人工污染样品结果表明，经过8 h就可完成不同浓度沙门氏菌的检测。与传统的分离培养方法、实时荧光PCR法及环介导等温扩增方法相比，节约了成本、减少了反应时间、缩短了检测周期，RPA方法适合于食品中沙门氏菌的快速检测。RPA检测方法的建立，为食源性致病菌中沙门氏菌的检测提供了新的技术方向，对我国食品安全监控和进出口食品的检验具有重要意义。