高效液相色谱法检测红糖中的焦糖色素
2019-01-28王秀娟曹程程杨桂霞山东中质华检测试检验有限公司
□ 王秀娟 曹程程 王 姣 杨桂霞 高 恒 山东中质华检测试检验有限公司
焦糖色素亦称焦糖,是一种复杂的混合物,具有胶体性质,可由碳水化合物(葡萄糖等)经单独加热合成,也可与食用的酸、碱、盐等共同合成[1]。焦糖色素颜色呈棕黑色至黑色不等,有液体形式存在,也有固体形式存在,在水中完全溶解,在有机溶剂中几乎不溶,具有聚合物的性质。一般而言,焦糖反应具有两种反应机理[2]:一种是胺参与下,由带有氨基的葡萄糖反应生成雪夫氏碱,再加热生成氮取代葡基胺的美拉德反应。另一种是单纯的焦糖化反应,即在约200 ℃的高温下,由碳水化合物生成醛类物质,再缩合成染色物质。红糖的生产主要依靠高温蒸煮,加热到119 ℃时,必须将糖液搅动,防止焦化。当加热到124~128 ℃时,即可起锅,超过130 ℃时,就会变焦,极有可能产生焦糖色素类副产物。因此,有必要建立一种快速检测红糖中焦糖色素的方法。
由于焦糖色素分子的复杂性,国内并无焦糖色素的检测方法报道,目前研究较多是焦糖色素中4-甲基咪唑的研究[3-6]。国外也未有成熟的检测红糖中焦糖色素的方法,涉及的相关检测方法也比较受限,像光度法、称重法、电子光谱法等的分离效果、检测准确性等均存在一定程度的不足。本文研究采用液相色谱-二极管阵列检测器检测红糖中的焦糖色素,目的是建立一种快速、准确的有效方法,为焦糖色素的标准化检测方法提供一定的参考价值。
1 材料与方法
1.1 实验原料
老红糖(赤砂糖)、月子红糖、阿胶红糖,购自市场。
1.2 仪器与试剂
高效液相色谱仪(1260 InfinityⅡ,美国安捷伦公司)、超声波清洗器(AS30600BDT,天津奥特赛恩斯仪器)、涡旋混合器(XW-80A,上海驰唐)、离心机(3-18KS,德国赛默飞)、电热鼓风干燥箱(BGZ-246,上海博讯)。
焦糖色素,购自上海爱普公司;超纯水,实验室自制;无水乙醇,分析纯;磷酸二氢钠,分析纯。
1.3 实验方法
1.3.1 液体焦糖的纯化
准确称取8 g(精确至0.001 g)液体焦糖于50 mL的离心管中,以4∶1的比例向离心管中加入乙醇和水(24 mL无水乙醇+6 mL 水),旋涡3 min,超声30 min(45 ℃)。取出后,低速(2 000 r/min)离心3 min,弃去上层液体。重复上述过程三次。将最终得到的固体沉淀物在烘箱中80 ℃烘干至恒重。
1.3.2 标准工作液的制作
准确称取纯化后的焦糖色素100 mg至10 mL容量瓶,用水溶解并定容至刻度,该标准储备液的浓度为10 mg/mL。
分别移取一定体积的标准储备液,用水稀释配制成标准工作液(浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL)。
1.3.3 色谱条件
色谱柱Agela SCX5,0μm,4.6 mm×250 mm;流速0.5 mL/min;柱温30 ℃;进样量5 μL;流动相为0.01 mol/L的磷酸二氢钠缓冲盐;色谱时间10 min,等度洗脱;检测器扫描波长范围190~620 nm,定量波长610 nm。
1.3.4 样品前处理
分别称取2.5 g老红糖(赤砂糖)、月子红糖、阿胶红糖的样品于离心管中,加入2.5 mL水、10 mL无水乙醇,涡旋混匀3 min,2 000 r/min离心3 min,弃去上清液,加入少量水溶解沉淀物,涡旋混匀,将溶液转移至25 mL容量瓶,加水定容至刻度,振荡混匀。溶液过0.22 μm滤膜后上机测试。
1.3.5 加标实验
以三种红糖样品为基质,分别进行加标实验,加标浓度为500 mg/kg和1 000 mg/kg两个水平,加标后的样品需静置半小时,之后与样品进行同步处理。
2 结果与讨论
2.1 液体焦糖的纯化
焦糖色素是一种复杂的混合物,其中包括了很多杂质,像一些小分子的低聚糖、水等,另外还有一些色素成分。因此液体焦糖在使用之前需进行纯化,这样可以使其响应值大大提高。乙醇/水(4+1)沉淀法是一种简单易行、效果好的方法。本研究采用此法对液体焦糖进行纯化,图1为纯化前后的液体焦糖色谱图,在图中可看出纯化后的液体焦糖响应值约为纯化前的三倍。
2.2 色谱条件的选择
李祥等的研究中测定了焦糖色素所带电荷为正电荷,且陈意光的研究中比较了食品中焦糖色素在C18色谱柱、氨基柱和强阳离子交换柱上的分离效果,综合研究结果,本实验选择强阳离子交换柱作为焦糖色素的分离色谱柱。
试验中选择磷酸二氢钠为流动相,分别比较了10、20、30 mmol磷酸二氢钠缓冲溶液的分离效果。结果表明,前两者无明显差异,后者导致焦糖色素的色谱峰变宽。本着节约成本的原则,试验中流动相选择10 mmol磷酸二氢钠缓冲溶液。结合研究报道中的结果得出在610 nm处基质干扰较少,因此定量波长选择610 nm。
2.3 前处理条件的选择
因红糖属于成分较为复杂的样品,所以在上机检测前需进行除杂处理,乙醇/水沉淀法可有效去除有机小分子杂质,纯化效果明显,因此选择此沉淀法进行样品的除杂。根据焦糖色素极易溶于水的特点,选用水溶解沉淀物,涡旋混合提取,回收率良好。
2.4 实验结果
2.4.1 标准曲线
以焦糖色素的浓度为纵坐标、峰面积为横坐标,计算得出的标准工作曲线为y=0.001x+0.002,线性范围50~1 000 mg/kg,R2值为 0.999。
图1 纯化前(A)与纯化后(B)液体焦糖的色谱图(1000 mg/L)
图2 红糖样品焦糖色素的色谱图
表1 样品中焦糖色素的含量及加标实验结果
2.4.2 方法的检出限、精密度和回收率
以三种红糖为加标样品,分别选取两个浓度进行实验,设置3个平行样。根据低浓度添加水平的S/N=3的方式进行计算,得出焦糖色素在红糖中的检出限为20 mg/kg。
该方法在三种红糖基质中的平均回收率在88.3%~98.5%,相对标准偏差在1.7%~5.1%。方法的准确性和精密度均较好。样品的色谱图如图2所示。回收率实验结果见表1。
2.4.3 红糖中的焦糖色素含量
经检测,选取的三种红糖中,老红糖中的含量较之另外两种高一些,为3 646 mg/kg;阿胶红糖和月子红糖中含量分别为2 815 mg/kg和2 568 mg/kg。风味红糖因加入了其他配料,如阿胶粉,因此,焦糖色素的含量相对于老红糖较低一些。
3 结论
由于红糖加工工艺的高温性特点,成品红糖中焦糖色素的含量较高。本研究首次建立了红糖中焦糖色素的高效液相色谱检测法,前处理简单,检出限低,准确性和精密度较好,是检测红糖中焦糖色素的有效方法,应用前景良好。