茎瘤芥新鲜种子总RNA提取研究

2019-01-28符纯愿郑晓华林涵梅广东省食品工业研究所有限公司

食品安全导刊 2018年30期

□ 符纯愿郑晓华林涵梅广东省食品工业研究所有限公司

1 引言

1.1 研究背景、目的及意义

茎瘤芥又名青头菜，属十字花科芸薹属芥菜种叶芥亚种大叶芥变种的变种，其最初由野生芥菜（Brassica juncea）进化而来，其进化次序是野生芥菜芥菜→大叶芥（Var. rugosa BaiLey）→笋子芥（Var. crassicauLis chen et ang）→茎瘤芥。在漫长的进化过程中，芥菜（Brassica. Juncea Coss. and Czern）分化出许多类型和品种。由茎瘤芥制成的榨菜质地脆嫩，风味鲜美，营养丰富，具有一种特殊的风味，具有特殊酸味和咸鲜味，脆嫩爽口，含丰富的人体所必需的蛋白质、胡萝卜素、膳食纤维、矿物质等，以及谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸等17种游离氨基酸。现今，人们对茎瘤芥所作的研究大多还停留在栽培、育种等宏观水平上[1-4]，在分子水平上的研究还比较少。

1.2 实验技术路线

核酸分为DNA和RNA两大类。根据DNA核蛋白和RNA核蛋白溶解度的研究发现，在氯化钠浓度为0.41 mol/L时，DNA核酸蛋白的溶解度仅为水中的1/10，当氯化钠浓度增加时，DNA核蛋白的溶解度逐渐增加，氯化钠浓度增至1 mol/L时，DNA核蛋白溶解度比水中大2倍。而RNA核蛋白在0.41 mol/L氯化钠浓度时仍有相当大的溶解度；当氯化钠浓度增大时，溶解度又相对减少目前，关于茎瘤芥种子RNA的提取还没有明确的方法，应用较多的有CTAB法、SDS法以及商业试剂盒Trizol等[5-6]。

CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，所以对于茎瘤芥这类含酚类物质及糖类物质较高的植物材料，采用CTAB法是比较理想的。该方法的另一个优点是在提取的前期能得到高含量的DNA与RNA，可根据实验的需要，分别进行纯化。本次试验根据前人的研究，由于茎瘤芥种子含有较高的酚类物质及糖类物质，为了使研究更准确，故采用CTAB法[7-9]。

2 材料与方法

2.1 材料

茎瘤芥种子（永安小叶，贮藏期为1年以内），由重庆涪陵种子公司提供。

2.2 茎瘤芥新鲜种子总RNA的提取方法

2.2.1 种子消毒处理

选择均一完好的茎瘤芥新鲜种子于培养皿，用2%过氧化氢浸泡5 min进行消毒处理，消毒完成用蒸馏水冲洗数次后，彻底洗净过氧化氢，晾干后-20 ℃冰箱下保存。

2.2.2 硫酸铜处理

取12份预处理好的种子，每份0.2 g，硫酸铜溶液的浓度为0、5、10、20 mg/L，分别用各种浓度的硫酸铜溶液对预处理好的种子在25 ℃下进行浸种处理，每一种浓度的溶液均对种子进行4 h、8 h、12 h处理，然后分别进行总RNA提取研究。

2.2.3 总RNA的提取方法

取经过氧化氢消毒的新鲜种子0.2 g放入预冷的研钵中，迅速加入2 mL预冷的提取液，快速研磨1 min，转移至2 mL离心管中混匀，65℃温浴30 min，期间混匀2～3次。加入0.5倍体积酚，混匀后冰浴15 min。12 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的离心管中，加入一倍体积酚∶氯仿（1∶1），混匀。

12 000 r/min离心10 min，取上清液装入新的离心管中，加入一倍体积氯仿，混匀（此步骤重复2次）。

12 000 r/min离心10 min，取上清液装入新的离心管中，加入1/3体积8 mol/L LiCl，混匀，在-20 ℃放置2 h。12 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用70%乙醇快速洗涤，将沉淀溶解于500 μL SSTE溶液中。加入一倍体积氯仿∶异戊醇（24∶1），混匀。

12 000 r/min离心10 min，取上清液装入新的离心管中，加入一倍体积氯仿∶异戊醇（24∶1），混匀（此步骤重复2次）。

12 000 r/min离心10 min，取上清液装入新的离心管中，加入50 μL 3mol/L NaAc，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20 ℃放置30 min。12 000 r/min离心10 min，轻轻弃去上清液，加入1 mL 70%乙醇洗涤。

12 000 r/min离心2 min，轻轻弃去上清液，加入1 mL 70%乙醇洗涤（此步骤重复2次）。

12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，注意不要倒出沉淀物。离心管壁残留液经瞬时离心后，用洗头吸出残液，室温晾干沉淀。加入25 μL已灭活的DEPC水，充分溶解RNA，-20℃保存备用[10-14]。

2.3 总RNA浓度和纯度的检测方法

当OD260/OD280比值在1.8～2.0时，认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以接受的，但当OD260/OD280比值小于1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，当OD260/OD280比值大于2.2时，说明RNA已经降解。

①计算OD260/OD280、OD260/OD230。② RNA浓度（μg/mL）=OD260×40 μg/mL×稀释倍数。③RNA得率（μg/g）=RNA浓度（μg/mL）×体积（mL）/取材量（g）。

3 结果与分析

3.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

从电泳图可以看出，都有比较清晰的条带。显示出28S rRNA和18S rRNA 2条完整的带型，且前者的亮度约为后者的2倍。试验结果表明得到的总RNA既未发生降解，又没有DNA、蛋白质、酚和多糖等杂质污染,质量和纯度较高。

3.2 RNA样品吸光度值的测定

RNA样品在230 nm、260 nm和280 m波长处的OD值见表1。

提取所得总RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0，OD260/OD230比值在2.0左右是最佳比值。说明提取所得总RNA受多糖、多酚和蛋白质等污染较少，纯度较高。

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳图

图2 总RNA琼脂糖凝胶电泳图

3.3 结果与分析

从电泳图中电泳条带可以看出，图1条带亮度最清晰，其中尤其是0mg/L，8 h的处理最为明显，无论从亮度比还是清晰度都特别明显，OD值分析中，OD260/OD280为1.94，OD260/OD230为2.26，均达到最佳比值，因此这个处理是最佳处理。其他的电泳图与OD值之间并没特别明显的规律，但总体来说，0 mg/L处理的都比其他浓度处理要清晰，可以说明硫酸铜浓度越高处理时间越长对于提取RNA有抑制的作用。

图3 总RNA琼脂糖凝胶电泳图

4 小结

在提取植物种子RNA的实验中，一般实验室都是利用种子培育出幼苗叶片为材料，经液氮研磨提取RNA。此过程必须要经过浸种催芽、幼苗培养、液氮研磨等过程，一般要用两周左右的时间才能进行RNA的提取并进一步开展实验。此方法是在实验条件不足的情况下通过添加提取液研磨来抑制RNase的活性，且不需要育种等培育过程，直接用处理好的种子进行研磨，整个实验过程约在10 h即能检测效果，能量大重复进行，尽管效果一般，但也能提取出能进行后续实验的RNA，对于一般性实验已经足够，可为植物RNA的提取提供新的思路。