两种抽吸模式下不同圆周卷烟主流烟气释放物及毒理学分析

罗彦波，庞永强，姜兴益，付亚宁，张洪非，李翔宇，朱风鹏，陈 欢

国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

卷烟的圆周会影响抽吸过程中烟气的形成和递送［1-2］。有研究表明，卷烟主流烟气焦油、烟碱和一氧化碳释放量随着圆周的减小而线性降低［3-4］。近年来细支卷烟（烟支直径为17.0±1.0 mm）等小圆周卷烟的产销量持续上升。与常规卷烟相比，小圆周卷烟具有焦油和有害成分释放量低、直径小、长度大和吸阻高等特点［5-6］。随着全球控烟履约工作的深入开展，细支卷烟已受到广泛的关注［7］。因此，研究不同圆周卷烟的主流烟气释放物及烟气毒理学特征对细支卷烟产品设计和质量监控具有重要意义。

目前，国内在细支卷烟的制造工艺及品质稳定性方面已有较多的研究报道［8-11］。甘学文等［12］研究了加拿大深度抽吸（HCI）模式下细支卷烟烟气常规指标的释放特点；田忠等［9］研究了制丝关键工序对细支卷烟主流烟气常规指标、有害成分及致香成分的影响；葛畅等［6］比较了细支卷烟与常规卷烟烟气指标的释放量差异；边照阳等［5］考察了市售细支卷烟的主流烟气有害成分释放量情况。有关细支卷烟烟气毒理学评价方面的研究报道较少，Coggins等［13］研究了烟支圆周对烟气体外毒理学评价结果的影响，但该研究中使用的细支卷烟不含滤嘴，与当前市售产品差异较大。另外，研究卷烟主流烟气常规指标的逐口释放量有助于了解卷烟的燃吸过程及焦油、烟碱的递送规律，可为卷烟产品设计及质量控制提供参考［14］。为此，制作3种叶组配方相同的细支、中支和常规卷烟，分析ISO和HCI抽吸模式下的卷烟主流烟气常规指标和有害成分（以烟气危害性评价指数H表示），评价卷烟烟气体外毒理学特征，并考察卷烟主流烟气常规指标的逐口释放规律，旨在了解不同圆周卷烟主流烟气成分的释放特征和毒理学差异，为适应WHO对细支卷烟的管控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

由相同烤烟型叶丝制作的不同圆周（24、20和17 mm）卷烟（福建中烟工业有限责任公司厦门卷烟厂提供）；中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞（中国科学院细胞库）；鼠伤寒沙门氏菌TA98（中国军事医学科学院提供）；大鼠S9活化系统（美国Moltox公司）。

烟碱（≥98.5%，国家烟草质量监督检验中心）；一氧化碳标准气体（国家标准气体研究中心）；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）；氰化氢溶液标准物质（58 μg/mL，中国计量科学研究院）；铵离子溶液标准物质（1 000 μg/mL，国家标准物质中心）；4-（甲基亚硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK，≥97%，加拿大Toronto公司）；液氮、氦气、氮气和氩气（99.999%，河南科益气体股份有限公司）；乙腈、甲醇和环己烷（色谱纯，德国Merck公司）；巴豆醛、苯酚和苯并［a］芘（B［a］P，≥99%），醋酸、乙酸铵和二甲亚砜（色谱纯），十二烷基硫酸钠（99%），环磷酰胺（97%），2-氨基芴（98%）（美国Sigma公司）。

CP224S电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）；SM450型20通道吸烟机（英国Cerulean公司）；RM200A和RM20H转盘型吸烟机， 92和 44 mm剑桥滤片（德国Borgwaldt-KC公司）；Agilent 7890A气相色谱仪（配火焰离子化检测器）、Agilent 1200高效液相色谱仪（配紫外检测器）、Agilent7890-5975气质联用仪（美国Agilent公司）；AA3连续流动分析仪（德国Bran+Luebbe公司）；IC3000离子色谱仪（美国Dionex公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（配荧光检测器，美国Waters公司）；API 4000三重四极杆质谱仪（美国AB公司）；J-II全自动定量浓缩仪（北京普立泰科仪器有限公司）；Q-POD Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；96孔板（美国Corning公司）；底层培养基（1.8%琼脂粉、2.0%葡萄糖和2.0%磷酸盐溶液）、顶层培养基（0.6%琼脂粉、0.5%NaCl溶液和0.5 mmol/L组氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液）（北京陆桥技术股份有限公司）；0.45 μm水相和有机相滤头（上海安谱科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 卷烟物理指标的测定

按照 GB/T 5606.1—2004［15］进行取样并随机分组，每组30支。将卷烟样品按照GB/T 16447—2004［16］的方法于温度（22±1）℃和相对湿度（60±2）%的环境中平衡48 h。依据GB/T 22838.2—2009［17］、GB/T 22838.3—2009［18］、GB/T 22838.4—2009［19］和 GB/T 22838.15—2009［20］的方法分别测试长度、圆周、质量和通风率。

1.2.2 卷烟主流烟气化学指标的分析

（1）烟气化学指标释放量及H指数分析。按照 GB/T 16447—2004［16］的方法将卷烟样品于温度（22±1）℃和相对湿度（60±2）%的环境中平衡48 h［16］。依据 GB/T 19609—2004［21］、GB/T 23355—2009［22］、GB/T 23356—2009［23］、YC/T 253—2008［24］、YC/T 377—2010［25］、YC/T 254—2008［26］、YC/T 255—2008［27］、GB/T 21130—2007［28］和 YQ/T 17—2012［29］的方法分别分析ISO和HCI抽吸模式下主流烟气中总粒相物（TPM）和焦油、烟碱、CO、HCN、NH3、巴豆醛、苯酚、B［a］P和 NNK 的释放量。由上述指标计算卷烟主流烟气H指数［30］。

（2）烟气常规指标逐口释放量分析。用RM20H转盘型吸烟机在ISO抽吸模式下抽吸卷烟。每轮抽吸20支卷烟，将每轮同一口序的烟气TPM捕集在同一张剑桥滤片上，分析后得到不同圆周卷烟主流烟气常规指标的逐口释放量。

1.2.3 卷烟主流烟气毒理学指标的评价

女孩的身体还非常虚弱，但她仍然帮着青辰将天葬师背回了屋中。天葬师昏迷着，心口的刀伤已经不再有鲜血流出，好似他的整个身体的血液，都已经干涸。

分别在ISO和HCI抽吸模式下抽吸卷烟，用92 mm剑桥滤片捕集卷烟主流烟气TPM，并用二甲亚砜萃取TPM，得到质量浓度为10 mg/mL的主流烟气TPM萃取溶液，分装后于-80℃保存备用。实验时，将其稀释到实验设计浓度。依据YQ/T 42—2013［31］、YQ 4—2011［32］和 YQ 3—2011［33］的方法分别评价卷烟烟气的细胞毒性、体外微核率和致突变性。

1.2.4 数据处理与分析

采用SPSS18.0软件进行数据统计分析，通过单因素方差分析和多重比较、配对t检验对不同样品进行统计学差异检验，并判定P＜0.05时具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 卷烟常规物理指标分析结果

3种卷烟样品的物理指标如表1所示。由表1可以看出，中支卷烟和细支卷烟的长度大于常规卷烟；吸阻和总通风率均随卷烟圆周的增大而降低；中支卷烟和细支卷烟的滤嘴通风率相当，且都显著高于常规卷烟；烟丝质量则随着卷烟圆周的增大而增加。

表1 3种卷烟样品物理指标Tab.1 Physical indexes of 3 cigarette samples

2.2 卷烟主流烟气化学指标分析结果

3种卷烟样品在ISO和HCI抽吸模式下的烟碱及7种有害成分释放量如表2所示。由表2可以看出，随着卷烟圆周的减小，卷烟主流烟气化学指标的释放量逐渐降低，这主要是由烟丝量减少所致。为了客观地比较不同圆周卷烟主流烟气化学指标的释放量，本研究中采用WHO推荐的单位烟碱释放量（mg/mg烟碱）方式［34］进一步比较了圆周对卷烟主流烟气常规烟气指标及H指数的影响。

3种卷烟样品的烟碱释放量、常规烟气指标单位烟碱释放量及H指数的数据统计结果如表3所示。由表3可以看出，在ISO抽吸模式下，3种卷烟样品之间存在显著性差异（P＜0.05）。在HCI抽吸模式下，常规卷烟与中支和细支卷烟之间存在显著性差异（P＜0.05）；细支卷烟与中支卷烟仅烟碱释放量和单位烟碱H指数之间存在显著性差异（P＜0.05）。

表3 2种抽吸模式下3种卷烟样品的单因素方差分析和多重比较结果①Tab.3 Results of single-factor analysis of variance and multiple comparisons of 3 cigarette samples under two smoking regimes

图1 ISO抽吸模式下3种卷烟常规烟气指标和有害成分（以H指数表示）的单位烟碱释放量Fig.1 Routine smoke indexes and 7 harmful components（expressed as H index）per unit nicotine yield of 3 cigarette samples under ISO smoking regime

图2 为HCI抽吸模式下3种卷烟主流烟气常规指标的单位烟碱释放量及H指数。可见，卷烟主流烟气7种有害成分（以H指数表示）的单位烟碱释放量随着圆周的减小呈降低趋势；而TPM、水分和焦油的单位烟碱释放量均呈现中支卷烟>细支卷烟>常规卷烟的趋势。这可能是由于细支卷烟参与燃烧的烟丝量明显少于中支和常规卷烟（经计算，3种卷烟参与燃烧的烟丝体积比为细支卷烟∶中支卷烟∶常规卷烟=1.00∶1.38∶1.48），且中支卷烟的烟碱释放量低于常规卷烟。通过比较2种抽吸模式下的释放量，发现HCI抽吸模式下主流烟气水分的单位烟碱释放量显著高于ISO抽吸模式。

图2 HCI抽吸模式下3种卷烟常规烟气指标和有害成分（以H指数表示）的单位烟碱释放量Fig.2 Routine smoke indexes and 7 harmful components（expressed as H index） per unit nicotine yield of 3 cigarette samples under HCI smoking regime

2.3 卷烟主流烟气毒理学评价结果

2.3.1 细胞毒性测试结果

基于单位TPM计算的卷烟烟气体外细胞毒性测试结果如表4所示。可以看出，在ISO抽吸模式下，体外细胞毒性呈现常规卷烟>细支卷烟≈中支卷烟的趋势；在HCI抽吸模式下，体外细胞毒性呈现中支卷烟≈常规卷烟>细支卷烟的趋势。说明在2种抽吸模式下，卷烟烟气体外细胞毒性整体上随着烟支圆周的减小而下降。对于相同圆周卷烟，HCI抽吸模式下的IC50值均略高于ISO抽吸模式，这与文献［13，35］报道的结果一致。

2.3.2 体外微核试验结果

基于单位TPM计算的卷烟烟气体外微核测试结果如表5所示。可以看出，与空白对照相比，所有样品的微核率均显著增加，并呈现剂量-反应关系，表明所有卷烟主流烟气TPM均存在一定的遗传毒性。

2.3.3 致突变性试验结果

基于单位TPM计算的卷烟烟气Ames试验结果如表6所示。可以看出，在较高的TPM浓度下，3种卷烟主流烟气均使TA98的回复突变菌落比值（回复突变菌落数/自发回复突变菌落数，MR）≥2，且呈剂量依赖关系，说明所有受试烟气TPM均具有一定致突变性。

表4 3种卷烟主流烟气TPM的细胞抑制率和IC50值Tab.4 Cell inhibition rate and IC50value for TPM of mainstream smoke of 3 cigarette samples （%）

表5 3种卷烟主流烟气TPM的体外微核测试结果Tab.5 Results of in vitro micronucleus assay for TPM of mainstream smoke of 3 cigarette samples （%）

表63 种卷烟主流烟气TPM的Ames试验结果Tab.6 Results of Ames test for TPM of mainstream smoke of 3 cigarette samples

对2种抽吸模式下不同圆周卷烟主流烟气的毒理学数据进行配对t检验，结果如表7所示。可以看出，ISO抽吸模式下，常规卷烟与中支和细支卷烟烟气细胞毒性数据的P值均小于0.05，说明具有显著性差异，常规卷烟的细胞毒性最高。HCI抽吸模式下，中支卷烟与细支卷烟烟气细胞毒性数据的P值小于0.05，说明具有显著性差异，且中支卷烟烟气的细胞毒性高于细支卷烟。不同圆周卷烟主流烟气的体外微核率和致突变性试验数据的P值均大于0.05，说明无显著性差异。

表7 2种抽吸模式下3种卷烟样品的毒理学数据配对t检验结果①Tab.7 Paired-t test results of in vitro toxicology data of 3 cigarette samples under two smoking regimes

2.4 常规烟气指标的逐口释放量变化

ISO抽吸模式下不同圆周卷烟主流烟气常规指标的逐口释放量如图3所示。可以看出，细支卷烟的抽吸口数较少。卷烟抽吸过程中，第1口（点燃抽吸）和最后1口（终止抽吸）的烟气释放量与其他口之间存在较大差异。第1口的差异主要来源于卷烟点燃过程，最后1口的差异主要是因为抽吸不完全［36］。不同圆周卷烟主流烟气常规指标的逐口释放量基本上呈现随抽吸口数的增加而增加的趋势，这可能是由于卷烟燃烧使烟支长度不断减小，导致未燃烧烟丝和滤嘴的过滤效果变差。

图3 3种卷烟样品常规烟气指标的逐口释放量Fig.3 Puff-by-puff releases of routine smoke indexes of 3 cigarette samples

3 结论

①ISO抽吸模式下，中支卷烟主流烟气常规指标的单位烟碱释放量和H指数最低；HCI抽吸模式下，不同圆周卷烟主流烟气单位烟碱H指数随着圆周的降低而下降。②卷烟烟气体外细胞毒性整体上随着烟支圆周的减小而下降，不同圆周卷烟烟气TPM的遗传毒性和致突变性无显著性差异。③不同圆周卷烟主流烟气常规指标的逐口释放量整体上呈现随抽吸口数增加而增加的趋势。