白念珠菌生物膜滞留菌与转录因子GCN4的研究进展

王佳佳 冯文莉

(1.山西医科大学，太原 030001；2.山西医科大学第二医院皮肤科，太原 030001)

白念珠菌是一种常见的条件致病性真菌，常寄居于人体的皮肤黏膜，由于菌株毒力的增加、宿主免疫力降低、外部环境改变等因素可导致人体浅表真菌感染或系统性真菌感染[1]。通过对中国西南地区的念珠菌血症患者进行回顾性研究，发现白念珠菌的感染比例为34.9%，是导致念珠菌血症的主要菌种[2]。目前治疗白念珠菌感染主要以唑类、多烯类、嘧啶类和棘白菌素类抗真菌药物为主。但由于抗真菌药的长期使用，临床上可以见到许多抗真菌治疗失败的案例，分析其主要原因就是真菌耐药性的增加。白念珠菌生物膜的形成是真菌药耐药性明显增加的重要原因之一，有研究显示，真菌生物膜比浮游细胞耐药性高1000 倍左右[3]。

白念珠菌生物膜耐药机制主要为[4]：细胞外基质作为一个物理屏障阻碍药物的进入；生物膜内细胞活性下降，对抗真菌药物不敏感；耐药基因的表达增加，如外排泵基因CDR1和MDR1、麦角甾醇合成途径中ERG11和ERG25等基因的表达量上调；生物膜内滞留菌的长期存在等，这些因素均可以导致白念珠菌生物膜耐药性的增强。其中滞留菌在白念珠菌生物膜耐药机制中的作用越来越突出。Fauvart等[5]发现临床上出现许多慢性难治性感染，大部分与滞留菌的存在有关，滞留菌可以作为慢性难治性白念珠菌感染治疗的一个新的突破点。此外，饥饿状态下滞留菌的形成比例增加[12]，而且转录基因GCN4表达增加[15]，所以滞留菌的形成与转录基因GCN4可能具有一定的相关性。

1 滞留菌

白念珠菌滞留菌(Persister cells)是生物膜随机产生的少量处于休眠状态的酵母型细胞，数量约占0.1%～1%，它们对抗真菌药物具有较强的耐受性，能够在高浓度抗真菌药物存在的条件下存活；当对滞留菌进行重新培养时，它可以重新构建相似比例的新生物膜，并具有相同的抗真菌药物敏感性[6]。

1.1 滞留菌与耐药性

白念珠菌生物膜耐药机制十分复杂，滞留菌作为其中的一个重要机制，越来越引起大家的关注。Del Pozo等[7]发现最成熟的抗真菌药耐药机制是生物膜中的微生物亚群采用独特的、高度保护的表型状态，即滞留菌。滞留菌与耐药菌有所不同：基因序列并没有发生任何改变，耐药性不会遗传[8]。它可通过“休眠-生长-增殖”的方式应对不良环境，维持自身生存和菌体结构稳定。Vogwill等[9]通过实验发现滞留菌与耐药菌之间代表的是一种互补的、而非竞争性的进化策略；当抗生素的暴露时间较长时，将有利于耐药菌的产生；如果抗生素暴露时间短暂，将有利于滞留菌的产生。滞留菌处于持久性休眠状态时，它几乎不发生细胞壁合成、翻译或产生拓扑异构酶活性，所以抗真菌药物能够与其结合但不破坏其靶分子的功能[7]。因此，与细菌中的滞留菌一样，白念珠菌滞留菌表现出非遗传性、多药耐受性的特征，被认为是高抗生素耐药性和真菌感染性疾病复发的主要决定因素[10]。

1.2 滞留菌与生物膜

滞留菌与生物膜之间存在密切的联系。虽然浮游状态和生物膜状态下都能检测到细菌性滞留菌[11]，但白念珠菌滞留菌迄今仅在生物膜中被观察到[6]。国内研究发现，营养缺乏(饥饿状态)对白念珠菌生物膜形成具有一定影响[12]：对数期、稳定期和饥饿态白念菌生物膜形成能力依次下降，且对数期和稳定期形成菌丝相生物膜，饥饿状态下形成酵母相生物膜；此外，给予抗真菌药物作用后，滞留菌比例依次升高；说明饥饿状态能够形成酵母相生物膜，且提高滞留菌的产生比例。而且Sun等通过研究[13]，再次确认只有在生物膜中才能观察到白念珠菌滞留菌，而浮游状态完全没有滞留菌的存在；并发现白念珠菌滞留菌主要在生物膜形成的表面黏附阶段产生(生物膜形成的0～2 h)， 表明表面黏附是形成和维持白念珠菌滞留菌所必需的。

2 转录基因GCN4

GCN4(又名：CaO19.1358基因)是一种氨基酸饥饿应答转录因子，位于白念珠菌第2号染色体，长度约为1468个碱基对，它与启动元件TGACTC相结合，参与了包括编码氨基酸生物合成酶系各基因在内的表达调节[14]。大多数酵母在任何一种氨基酸饥饿的生长环境中均可激活GCN2，使eIF2磷酸化，抑制大多数蛋白质的生物合成，并特异性增强转录基因GCN4的合成[15]。

2.1 转录基因GCN4与耐药性

白念珠菌的耐药机制除了耐药基因的表达增加外，还进化出了应激反应途径，使细胞能够应对环境中存在的各种压力[16]，如氧化应激反应等。白念珠菌的氧化应激反应是由翻译起始的氧化特异性调控介导的，Sundaram等[17]发现包括过氧化氢、重金属镉和硫醇氧化剂在内的氧化剂能够抑制翻译起始，且都以剂量依赖性的方式抑制白念珠菌的生长；除了抑制全部的翻译起始外，eIF2a磷酸化还通过翻译调控机制增强了酵母中GCN4mRNA的表达，对白念珠菌GCN4的产生有诱导作用，而且GCN4是白念珠菌对过氧化氢产生耐受性所必须的，所以GCN4在参与白念珠菌的氧化应激反应的同时，对白念珠菌的耐药性也产生了影响。GCN4是一种参与氨基酸内部稳态信号传导的转录因子，与酵母中约70%的MFS-MDR转运蛋白编码基因的转录调控有关[18]。国外研究发现，酵母对苯甲酸的反应和耐受涉及到一种多耐药转运蛋白Tpo1，而它主要受转录因子GCN4和STP1的调控[19]。所以，转录基因GCN4与白念珠菌耐药性密切相关。

2.2 转录基因GCN4与生物膜

氨基酸饥饿条件可以促进白念珠菌的形态发生变化，包括菌丝分化和生物膜的形成，从而影响白念珠菌毒力[20]。而GCN4作为一种氨基酸饥饿应答转录因子，在白念珠菌中诱导了两个不同的过程来响应氨基酸饥饿：激活氨基酸生物合成和触发形态变化[21]。Sundaram等[21]测试了白念珠菌gcn4/gcn4突变株与野生株在微发酵剂中形成生物膜的能力，发现在营养充足的条件下，两种菌株产生的生物膜总量及酵母和菌丝形成的比例相似，说明GCN4对生物膜的形成作用与触发形态变化无关；而在营养不足造成氨基酸饥饿时，突变株的生物膜生长细胞比例明显降低；证明氨基酸饥饿状态下，生物膜的有效生长离不开转录因子GCN4。所以，氨基酸饥饿的条件下[22]，GCN4对生物膜形成的影响类似于GCN反应(GCN-like response,即激活氨基酸生物合成)，虽然在浮游生物种群没有观察到这种反应，但生物膜的情况可能有所不同，它们似乎对蛋白质合成的需求增加了，因此氨基酸限制可能出现地更快。在这些条件下，GCN4的调节作用对生物膜的形成起决定性作用。

3 滞留菌与转录基因GCN4的相互联系

白念珠菌滞留菌和转录基因GCN4均与营养环境相关。如在饥饿状态下，能够提高白念珠菌滞留菌的产生比例；而且在营养缺乏的条件下，必然会造成氨基酸的相对不足，而在氨基酸饥饿状态下，可以使转录基因GCN4表达量上调。

滞留菌的形成与环境的微妙变化相关[23]。在营养缺乏等不适宜生存的条件下，Li等[24]通过分析白念珠菌生物膜滞留菌基因和蛋白质表达谱，发现滞留菌的存在的原因可能是：能够持久下调主要的能量生成途径和蛋白质合成，并增强与应激反应有关的紧张性代谢活动和蛋白质表达。具体如：在营养缺乏的环境下[24]，白念珠菌生物膜滞留菌通过抑制糖酵解和TCA循环(三羧酸循环)的催化酶，导致NADH的产生减少，并且通过电子传递链的氧化刺激超氧化物和下游ROS的产生，能够持久下调主要的能量生成途径；降低与蛋白质合成和细胞生长有关的高度保守蛋白质Tma19的表达；下调翻译时促进多肽链延伸的主要延伸因子(如EF-1、EF-2)等。总之，这些数据表明白念珠菌生物膜的滞留菌似乎进入了代谢不活跃状态以生存。此外，白念珠菌生物膜滞留菌还启动主动应激反应。通过实验发现[24]，应激反应所必需的许多蛋白质丰度的大幅度增加，表明白念珠菌生物膜滞留菌可能采取积极的防御策略来应对极端的抗真菌刺激，如主导表型转换(如BMH1、RAS1和ASC1)，表面黏附(如ALS3、MP65和CSP37)，群体感应和细胞周期控制(如SMT3、SLK19和GRP2)的各种蛋白质的表达水平增加。这些调节蛋白的激活表明，白念珠菌生物膜滞留菌可能通过调节它们的生长以及与其他细胞的相互作用来为自我保护模式做好准备。

国内研究发现，在致死剂量的两性霉素B的作用下，抑制核酸生物合成对白念珠菌生物膜内的滞留菌的形成影响不大[25]。国外发现，在进行关于大肠杆菌对氨基糖苷耐受性研究时，氨基酸生物合成有助于耐受庆大霉素的大肠杆菌滞留菌的形成[26]，而且在研究AldB(醛脱氢酶)根据环境压力控制大肠杆菌滞留菌的形成时发现，同样的菌株在氨基酸有限的条件下产生了更多的滞留菌[27]。GCN4作为一种氨基酸饥饿应答转录因子，在参与氨基酸生物合成的同时，也必然与滞留菌的形成相关。而且，Mittal等[28]发现GCN4抑制了整体翻译水平，翻译起始因子IFs和延伸因子EFs的丰度被降低，而氨基酸生物合成中涉及的多条通路都被显著上调，通过分析各种酵母菌株的信使RNA和蛋白质丰度、核糖体占用率和蛋白质合成率，证明GCN4对白念珠菌滞留菌的存在有不可替代的作用，它可能减少了其他途径的蛋白质合成，延长白念珠菌的寿命，使滞留菌能够存活。

4 总 结

白念珠菌是一种常见的真菌病原体，常寄居于人体内，当人体免疫力降低、外部环境改变时可转变为致病菌，从而引起浅表感染或系统性感染。滞留菌是处于非生长状态的菌细胞，被认为是导致对多种药物耐药的主要原因，与临床上许多慢性难治性感染息息相关。目前对于滞留菌引起的慢性难治性白念珠菌感染的治疗尚处于探索阶段，了解滞留菌的相关形成机制十分重要。在本文中对白念珠菌滞留菌与转录基因GCN4的关系的进行了分析，希望对了解滞留菌的形成机制有所帮助。白念珠菌滞留菌的抗真菌耐受性可能是由微妙的代谢调节和协调的压力适应引发的，了解滞留菌对治疗慢性难治性白念珠菌感染意义深远。一旦滞留菌形成机制明朗，将推动滞留菌清除方面的研究，有助于新型抗真菌药物的研发，由滞留菌引起的慢性难治性白念珠菌感染也将取得新的研究进展。