超声辅助有机溶剂回流提取水飞蓟籽中水飞蓟素工艺的优化

张丽芳， 林 霞， 冯星海， 高东香

（九江学院， 药学与生命科学学院， 江西 九江332000）

水飞蓟素为菊科植物水飞蓟籽提取所得的天然黄酮类成分， 具有保护肝细胞膜、 改善肝功能等药理活性［1-2］， 临床上主要用于慢性肝损伤、 慢性肝炎、 肝硬化等辅助治疗［3-4］。 近年研究发现， 水飞蓟素在降脂、 降糖、 防治动脉粥样硬化、 免疫调节、 抗肿瘤等方面也有显著效果［5-7］， 其有效成分以“双宾”， 即水飞蓟宾和异水飞蓟宾含有量最高， 药理活性最强［1］。

黄酮类成分的提取工艺包括浸提法［8］、 回流提取法［9］、 超 声 波 提 取 法［10］、 微 波 提 取 法［11］、 酸 碱 提 取法［12］、 酶解提取法［13］、 超临界CO2萃取法［14］等， 其中水飞蓟素传统提取工艺大多采取有机溶剂浸提或回流法， 尽管前者提取效率高， 杂质少， 但存在溶剂用量大、 热敏性组分易破坏、 周期长等缺点［9］。 超声提取是近年来应用于中药材有效成分提取工艺的一种较成熟的技术［15］， 其机理主要是利用超声波产生的强烈振动、 空化效应、 搅拌等作用使植物细胞壁破裂， 加速细胞内有效成分向溶剂溶解扩散， 从而提高中药提取率， 缩短提取时间， 节约溶剂， 避免长时间高温对活性物质的降解［16］。

为了将回流提取和超声提取的优点结合起来， 本实验系统考察超声辅助有机溶剂回流提取对水飞蓟籽中水飞蓟素提取率的影响。 此外， 目前水飞蓟素得率的测定主要以粗提物中黄酮含有量为评价指标， 并不能真实反映产物中主要活性成分含有量， 故又建立HPLC 法测定水飞蓟宾、异水飞蓟宾含有量， 从而更客观地评价各提取条件的优劣。

1 材料

SB25-12DTD 型超声清洗机（40 kHz、 600 W， 宁波新芝生物技术股份有限公司）； RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； TGL-16B 型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）； AL204 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； TU-1901 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）； Varian Prostar 230 高效液相色谱仪系统（美国瓦里安公司）。 芦丁、 水飞蓟宾、 异水飞蓟宾对照品（含有量98%， 上海源叶生物科技有限公司）。 水飞蓟籽购自河北省安国市瑞琪中药材有限公司。 甲醇为色谱纯（美国Merck 公司）； 石油醚、 无水乙醇、 乙腈、 乙酸乙酯、 丙酮、 正己烷、 硝酸铝、 氢氧化钠、 三氯化铝为分析纯（天津大茂化学试剂厂）。

2 方法

2.1 水飞蓟素提取 水飞蓟籽冷冻干燥24 h 后粉碎， 过40 目筛， 粉末置于索氏提取器中， 按1 ∶8 料液比加入正己烷， 脱脂6 h 以上， 挥干溶剂， 得到无脂药材粉末。 称取2 g， 加入不同体积有机溶剂， 超声辅助水浴热回流提取， 滤液减压蒸馏， 得到黄色浸膏提取物。

2.2 单因素试验 考察了甲醇、 乙醇、 乙腈、 乙酸乙酯、丙酮对水飞蓟籽中总黄酮、 水飞蓟素提取率的影响， 测得各溶剂下总黄酮得率分别为3.47%、 3.07%、 3.01%、2.37%、 2.65%， 即甲醇和乙醇的提取能力较强。 尽管甲醇提取率最高， 但其提取液色泽最深， 并且含有大量不溶性杂质， 基于提取效率、 安全性、 经济性考虑， 最终确定乙醇作为提取溶剂。 因素水平见表1。

表1 单因素试验因素水平

2.2.1 提取时间 取脱脂药材粉末2 g， 加入30 mL 无水乙醇， 加热回流至沸腾开始计时， 超声功率300 W， 设定提取时间15、 30、 45、 60、 90 min， 测定总黄酮、 水飞蓟素得率。

2.2.2 超声功率 取脱脂药材粉末2 g， 加入30 mL 无水乙醇， 加热回流至沸腾开始计时， 提取时间60 min， 设定超声功率240、 300、 360、 480、 600 W， 测定总黄酮、 水飞蓟素得率。

2.2.3 料液比 取脱脂药材粉末2 g， 加入无水乙醇， 加热回流至沸腾开始计时， 提取时间60 min， 超声功率300 W， 设定料液比1 ∶9、 1 ∶12、 1 ∶15、 1 ∶20、 1 ∶25，测定总黄酮、 水飞蓟素得率。

2.3 正交试验 在单因素试验基础上， 选择乙醇作为提取溶剂， 总黄酮、 水飞蓟素得率作为评价指标， 提取时间（A）、 超声功率（B）、 料液比（C） 作为影响因素， 进行L9（33） 正交试验。 因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平

2.4 提取方法比较 精密称取脱脂药材粉末2 g， 分别采取回流法、 超声法、 超声辅助回流法进行提取。 其中， 回流条件为无水乙醇30 mL， 回流60 min， 超声条件为无水乙醇30 mL， 提取时间60 min， 超声功率360 W； 超声辅助回流条件为无水乙醇30 mL， 加热回流至沸腾开始计时，提取时间60 min， 超声功率360 W， 各条件平行提取3 份，测定总黄酮、 水飞蓟素得率。

2.5 总黄酮得率测定 以芦丁为对照品， 通过NaNO2-Al （NO3）3-NaOH 比色法测定总黄酮含有量。 水飞蓟素提取物加入甲醇溶解， 定容于10 mL 量瓶中， 0.45 μm 微孔滤膜过滤， 取0.2 mL 续滤液于50 mL 量瓶中， 加入5%NaNO2溶 液1 mL， 摇 匀 后 静 置6 min， 再 加 入10% Al（NO3）3溶液1 mL， 摇匀后静置6 min， 再加入10%NaOH 溶液10 mL， 70% 乙醇定容至刻度， 混匀， 静置15 min， 于504 nm波长处测定吸光度， 计算总黄酮得率， 公式为得率＝［（总黄酮质量浓度×体积×稀释倍数） ／药材质量］ ×100%。

2.6 水飞蓟素得率测定 采用HPLC 法， 条件为Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm）； 流动相冰醋酸（pH＝3） -甲醇（50 ∶50）； 检测波长288 nm； 柱温40 ℃；进样量20 μL。 精密称取药材提取物20 mg， 流动相溶解定容于10 mL 量瓶中， 0.22 μm 微孔滤膜过滤， 取0.5 mL 续滤液置于10 mL 量瓶中， 流动相定容， 混匀， 作为供试品溶液。 采用峰面积归一化法， 参考对照品出峰时间和峰面积， 计算水飞蓟素得率， 公式为得率＝｛［（水飞蓟宾质量浓度＋异水飞蓟宾质量浓度） ×体积×稀释倍数× （浸膏质量／20 mg） ］ ／药材质量｝ ×100%。

3 结果

3.1 线性关系考察 以质量浓度为横坐标（X）， 吸光度为纵坐标（A） 回归， 得芦丁方程为A ＝0.011 2X-0.032 6（R2＝0.999 9）， 在8.00～56.00 μg／mL 范围内线性关系良好； 以质量浓度为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 回归， 得水飞蓟宾、 异水飞蓟宾方程分别为Y ＝17.441X ＋346.63（R2＝0.999 2）、 Y＝21.345X＋178.56（R2＝0.999 1），分别在2.00～100.00、 0.80～60.00 μg／mL 范围内线性关系良好。 色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

3.2 单因素试验

3.2.1 提取时间 图2 显示， 随着提取时间增加， 总黄酮、 水飞蓟素得率不断增加， 在60 min 时最高； 继续延长提取时间， 两者得率反而下降， 表明提取时间过长将使部分成分发生分解。 因此， 提取时间选择45～90 min。

图2 提取时间对总黄酮、 水飞蓟素得率的影响

3.2.2 超声功率 图3 显示， 超声功率300 W 时总黄酮得率最高， 表明细胞壁破碎相对较完全， 乙醇大量渗入细胞内部， 成分得到充分溶解， 并经由细胞内外渗透压驱使随溶剂转移到细胞外， 但随着超声功率进一步增加其得率逐渐下降， 表明正被进一步降解； 水飞蓟素得率变化较总黄酮平缓， 在360 W 最高， 之后逐渐下降。 因此， 超声功率选择240～360 W。

图3 超声功率对总黄酮、 水飞蓟素得率的影响

3.2.3 料液比 图4 显示， 随着料液比增加， 总黄酮、 水飞蓟素得率均有所增加； 当料液比超过1 ∶20 时， 前者得率保持稳定； 当料液比超过1 ∶15 时， 后者得率无明显变化。 综合考虑经济成本和成分得率， 料液比选择1 ∶15～1 ∶25。

图4 料液比对总黄酮、 水飞蓟素得率的影响

3.3 正交试验 在单因素试验基础上， 按照表2 因素水平进行正交试验， 结果见表3， 方差分析见表4。 由表可知，各因素影响程度依次为提取时间（A） ＞超声功率（B） ＞料液比 （C）； 总黄酮、 水飞蓟素最优水平组合分别为A2B2C3、 A2B3C1， 两者方差分析结果基本吻合： 因素A 影响显著（P＜0.05）， 故选择水平2， 而B、 C 影响不显著（P＞0.05）， 选择任一水平均可， 综合考虑经济成本和水飞蓟素得率， B 选择3 水平， C 选择1 水平为宜。 综上所述，最优工艺为A2B3C1， 即提取时间60 min， 超声功率360 W，料液比1 ∶15。

表3 试验设计及结果

表4 方差分析

3.4 验证试验 精密称取脱脂药材粉末2 g， 加入30 mL无水乙醇， 加热回流至沸腾开始计时， 提取时间60 min，超声功率360 W， 平行3 份， 测得总黄酮、 水飞蓟素平均得率分别为3.60% （RSD ＝0.05%）、 1.64% （RSD ＝0.13%）， 表明工艺稳定可行， 重复性好。

3.5 提取方法比较 结果见表5， 可知超声辅助有机溶剂回流提取法提取效果优于乙醇热回流提取法和超声提取法。

表5 3 种提取方法比较

4 讨论

国内水飞蓟素生产基本上是原料直接加工， 对水飞蓟种皮分离性能要求高， 壳渣中的蛋白、 残留脂肪将浪费大量溶剂， 提取物杂质多， 不利于精制， 故改进提取工艺对相关产品质量意义重大。

本实验优化超声辅助有机溶剂回流提取水飞蓟籽中水飞蓟素工艺， 发现在提取时间60 min、 超声功率360 W、料液比1 ∶15 条件下， 总黄酮、 水飞蓟素得率最高， 分别达3.60%、 1.64%， 与常规乙醇热回流提取法、 超声提取法比较， 该方法可明显提高有效成分得率， 同时能缩短浸提时间， 降低溶剂用量， 为制药工业中水飞蓟素及水飞蓟宾提取工艺的改进提供参考依据。