UPLC-Q／TOF-MS／MS 法同时测定丹参川芎嗪注射液中5 种酚酸

2019-01-25申兰慧杨敏智

中成药 2019年1期

程栋，申兰慧，金坚，杨敏智∗

（1. 江南大学药学院，江苏无锡214122； 2. 无锡市药品安全检验检测中心，江苏无锡214028）

丹参川芎嗪注射液由丹参、盐酸川芎嗪、甘油、注射用水组成，制备方法为丹参水提后经过石硫法处理，醇沉，再添加盐酸川芎嗪和辅料制成［1］，具有抗血小板聚集、扩张外周血管、改善微循环等作用，适用于闭塞性脑血管疾病、缺血性心血管疾病，如急性脑梗死、慢性脑供血不足、缺血性心脑病等，但其临床应用较广泛的同时也存在不良反应［2-4］。目前。丹参川芎嗪注射液质量标准中只对丹参素进行含有量限定，但中药注射液成分复杂，其他物质也可能对疾病治疗起着重要作用［5-6］。本实验通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱法（UPLC-Q-TOF-MS／MS）同时测定丹参川芎嗪注射液中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B 的含有量，并结合相应对照品推导各成分二级质谱裂解途径［7-12］，为该制剂质量控制提供数据支持。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 UPLC-6530AQ-TOF MS仪，配置MassHunter 工作站等（美国Agilent 公司）； XSE205 电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； S100H 超声仪（德国Elmasonic 公司）； Millipore 纯水系统（美国Millipore 公司）。

1.2 试药丹参素钠（批号110855-201613）、咖啡酸（批号11885-200102）、原儿茶醛（批号110810-201608）、迷迭香酸（批号 111871-201505）、丹酚酸B （批号111562-201615）对照品均购自中国食品药品检定研究院。丹参川芎嗪注射液（贵州某公司生产，批号20160436、 20161008、20161012、 20170219、 20170220， 5 mL／支，其中批号20160436 作为方法学验证样品）。甲醇为色谱纯（德国默克公司）；甲酸为分析纯（美国Acros公司）；超纯水由Milli-Q 仪器制备。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ZORBAX Eclipse Plus-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm， 1.8 μm）；流动相乙腈（A） -0.5%甲酸（B），梯度洗脱（0 ～5 min， 5% ～8%A； 5～12 min， 8% ～40% A； 12 ～13 min， 40% ～80%A； 13～15 min， 80%A； 15 ～15.1 min， 80% ～5%A； 15.1～17 min， 5%A）；柱温35 ℃；体积流量0.3 mL／min；进样量1 μL。

2.2 质谱条件 ESI 负离子检测方式；干燥气温度350 ℃，体积流量10 L／min；毛细管电压3.5 kV；雾化气压力45 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；碎裂电压105 V；锥孔电压75 V； OCT 1RF Vpp 750 V；洗针时间3 s；扫描速率2 spectra／s，体积流量0.3 mL／min；扫描方式MS、 MS／MS 全扫描，扫描范围m／z 50～1 000。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液分别精密称取对照品丹参素钠11.61 mg、丹酚酸B 11.95 mg、迷迭香酸11.64 mg、原儿茶醛10.38 mg、咖啡酸10.31 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇超声15 min，放冷至室温，甲醇稀释至刻度，制得贮备液，分别精密量取3、 0.5、 1、0.05、 0.4 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇定容，即得。2.3.2 供试品溶液精密量取本品1 mL，置于5 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀， 0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 质谱分析见表1、图1～2。

2.5 线性方程考察精密量取“2.3.1” 项下对照品溶液3 mL，置于15 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，在“2.1” ～ “2.2” 项条件下进样1、 3、5、 7、 9、 10 μL 测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分MS 参数Tab.1 MS parameters for various constituents

图1 各成分总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

图2 各成分二级质谱图Fig.2 MS2 spectra of various constituents

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 定量限、检出限考察取“2.3.1” 项下对照品溶液，逐级稀释后在“2.1” ～ “2.2” 项条件下进样测定，测得丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B 检出限（S／N ＝3）分别为0.027、 0.012、 0.011、 0.018、 0.013 μg／mL，定量限（S／N ＝10）分别为0.081、 0.036、 0.033、0.054 、 0.039 μg／mL。

2.7 精密度试验取“2.3.1” 项下对照品溶液，在“2.1” ～ “2.2” 项条件下进样测定6 次，测得丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B 峰面积 RSD 分别为 1.9%、 0.6%、 2.2%、1.1%、 1.7%，表明仪器精密度较好。

2.8 重复性试验取本品6 份（批号20160436），按 “2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” ～ “2.2” 项条件下进样测定，测得丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B 峰面积 RSD 分别 0.2%、 1.6%、 1.3%、 0.3%、0.4%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验取同一批本品（批号20160436），按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、 2、 4、 6、 8、 12 h 在“2.1” ～ “2.2”项条件下进样测定，测得丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B 含有量RSD 分别为1.4%、 1.9%、 2.6%、 1.7%、 1.6%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验精密量取本品（批号20160436） 0.5 mL，置于5 mL 棕色量瓶中，平行6 份，按1 ∶1 比例加入适量对照品，甲醇稀释至刻度，摇匀，在“2.1” ～ “2.2” 项条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

2.11 样品含有量测定取本品6 批，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” ～“2.2” 项条件下进样测定，平行3 份，计算含有量，结果见表4。

3 讨论

本实验考察了乙腈-10 mmol／L 乙酸铵（含0.1%甲酸）、甲醇-0.5% 甲酸、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.5%甲酸，发现以乙腈-0.5% 甲酸为流动相时分离效果明显。乙腈洗脱效果比甲醇强，可使中药注射液成分得到很好地分离，而且在流动相中加入适当比例甲酸有利于改善成分准分子离子峰峰型，使其更加尖锐对称，同时基线也相对平稳。

在咖啡酸提取离子流图中，该成分在4.02 min出现离子峰，同时在1.58 min 也出现该类型峰。丹参素脱去1 个H2O 后形成双键，从而变为咖啡酸，两者相对分子质量刚好相差18，其原因可能为样品经色谱柱液相分离时咖啡酸、丹参素未发生变化，而进入ESI 高温、高压离子源时后者部分发生结构变化，脱去1 个水分子而形成前者。

从样品总离子流色谱图中发现，还有多种其他成分存在，而且原儿茶醛、丹酚酸B、咖啡酸、迷迭香酸具有提高受损细胞活力、抑制动脉粥样硬化形成、增强凝血和抗凝血双向调节、抗心肌细胞缺氧复氧损伤等作用，有助于临床治疗。因此，本实验建立UPLC-Q-TOF-MS／MS 法同时测定丹参川芎嗪注射液中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B 的含有量，有利于提高该制剂临床安全性，也可为其质量控制提供参考。