DPPH法测定树上虾丙酮部位自由基清除能力

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(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530001；2.广西师范学院 化学与材料学院，广西 南宁 530001；3.广西南宁市第五十六中学，广西 南宁 530001)

活性氧在许多疾病的发病机制中起着重要作用，如呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、局部或全身炎症性疾病、糖尿病、动脉粥样硬化、癌症和神经退行性疾病[1-3]。活性氧(ROS)在正常氧化代谢过程中不断在人体内形成，并通过由具有抗氧化活性的酶组成的内源性抗氧化防御系统清除。但外源性细胞中活性氧由外源源形成或未被充分去除，则可能发生氧化应激。因此，抗氧化剂特别是天然抗氧化剂的清除作用受到广泛关注[4-5]。本实验通过冷浸法得到树上虾丙酮提取物，采用DPPH和羟自由基体系，评估其对自由基清除能力。

1 材料与仪器

UV1901型紫外可见分光光度计(北京普析电子科技有限公司)；树上虾药材购于广西百色；芦丁标准品购于百灵威试剂公司(北京)。所有试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 树上虾丙酮提取物制备

称取20 g树上虾粉末，加入200 mL丙酮(95%)，冷浸72 h。重复上述操作3次，合并提取液。旋转蒸发回收溶剂，得到树上虾丙酮提取物。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线测定

精密吸取芦丁对照品溶液(l mg/mL)于10 mL量瓶中，分别加5%亚硝酸钠0.4 mL，静置6min，加入5%硝酸铝0.4 mL，静置6 min。加5%氢氧化钠试液4.0 mL，用95%丙酮稀释至刻度，摇匀。静置15 min，在510 nm处测定吸收度。以吸收度对溶液浓度进行回归分析，绘制标准曲线，推出回归方程。

2.2.2 树上虾丙酮提取物总黄酮含量测定

将芦丁标准溶液换为固定浓度提取物溶液，同上操作测定吸光度，多次测量求平均值。根据标准曲线计算总黄酮的芦丁当量，总黄酮含量以每克干物质的芦丁当量(mg)表示，并计算提取得率。

2.3 二苯基苦味肼基自由基(DPPH)体系[4]

取不同浓度树上虾丙酮提取物提取物溶液(0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0 mg/mL)加入8 mL DPPH(0.004%)溶液中。在最大波长处(517 nm)测吸光度，直到平衡为止。清除率计算公式如下：S %=(1-A样品)/A空白×100%。其中，A空白为未加药液的DPPH溶液的吸光度，A样品为加入药液的DPPH溶液的吸光度。

2.4 羟自由基体系

以蒸馏水将75 mmo1/L邻二氮菲无水乙醇溶液稀释至7.5 mmol/L，依次往50 mL比色管中加入1.0 mL浓度7.5 mmol/L邻二氮菲溶液，5 mL pH值7.4 PBS，1.0 mL FeSO4溶液，一定量的抗氧剂溶液，1.0 mL H2O2应用液，以蒸馏水补充体积至25 mL。37 ℃保温反应60 min，测A510。既加抗氧剂，又加H2O2的为加药管;不加抗氧剂，只加H2O2的为损伤管;未损伤管两者均不加。羟自由基清除率s= [A加药-A损伤)]/[A未损伤-A损伤] 100%。若为负值，则表示此时表现促氧化性；若为正值，则表示此时表现抗氧化性。

3 结果

3.1 树上虾丙酮提取物总黄酮含量测定结果

以吸收度对溶液浓度进行回归分析并绘制标准曲线，得到回归方程为：y=9.6778x+0.0167(R =0.9992)。树上虾丙酮提取物的总黄酮含量根据线性方程计算得到，其总黄酮含量为31.2 mg/g。

3.2 树上虾丙酮提取物对DPPH自由基的清除能力

3.2.1 不同浓度提取物对DPPH自由基的清除能力

为了评估树上虾对自由基的清除能力，本论文测定了不同浓度树上虾丙酮提取物对DPPH自由基的清除能力，如图1。在较低药液浓度下，树上虾表现出一定的DPPH自由基清除能力，药液浓度为0.2 mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率就达到了30.9%。药液浓度为0.5～0.8 mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率超过50%，处于54.3%～68.9%的范围。药液浓度为1.2和1.5 mg/mL时，提取物的DPPH自由基清除率为71.5%和76.7%，分别为药液浓度0.2 mg/mL时数值的2.31和2.48倍。药液浓度为1.8 mg/mL时，提取物的DPPH自由基清除率达到了84.9%。

图1 不同浓度树上虾丙酮提取物对DPPH自由基的清除能力

3.2.2 不同时间提取物对DPPH自由基的清除能力

图2 不同时间树上虾丙酮提取物对DPPH自由基的清除能力(浓度=2.0 mg/mL)

树上虾丙酮提取物在不同作用时间对DPPH自由基的清除率如图2所示。可见，在将树上虾丙酮提取物加入时，提取物即表现出60.5%的清除率，说明该提取物与DPPH自由基的作用非常迅速。在作用时间为10 min时，树上虾丙酮提取物的DPPH自由基清除率为74.9%，为初始清除率的1.24倍。在作用时间为10 min后，树上虾丙酮提取物的DPPH自由基清除率增长较为缓慢，作用时间70 min时，树上虾丙酮提取物的DPPH自由基清除率为76.7%。

3.3 树上虾丙酮提取物对羟基自由基的清除能力

图3表示的是树上虾丙酮提取物对羟基自由基的清除能力。药液浓度为0.2 mg/mL时，树上虾丙酮提取物对羟基自由基的清除率为负值，表明该浓度的药液对羟自由基表现出促氧化性。药液浓度为0.5 mg/mL时，树上虾丙酮提取物的羟自由基清除率为正值，表明该浓度的药液对羟自由基表现出抗氧化性。浓度为0.8 mg/mL时，提取物的羟自由基清除率迅速增加为36.2。浓度为1.2和1.5 mg/mL时，树上虾丙酮提取物的羟自由基清除率分别达到了78.5%和85.5%。随着药液浓度继续增加，树上虾丙酮提取物的羟自由基清除率超过了100%。

图3 树上虾丙酮提取物对羟基自由基的清除能力

3.4 树上虾丙酮提取物对DPPH和羟基自由基的EC50值

通过不同浓度的树上虾丙酮提取物对DPPH自由基的清除率，得到该提取物对DPPH自由基的EC50值为0.43 mg/mL。同理得出树上虾丙酮提取物对羟自由基的EC50值为1.06 mg/mL。该提取物对自由基具有良好的清除能力，可能与其黄酮类物质有关。

4 结论

本实验通过冷浸的方式得到树上虾丙酮提取物，并测定其总黄酮含量。采用DPPH体系研究该提取物对自由基的清除能力。研究结果表明，树上虾丙酮提取物的DPPH自由基清除能力与药液浓度有关，药液浓度为0.2 mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率就达到了30.9%。随着药液浓度增加，提取物对DPPH自由基的清除率增大，提取物的DPPH自由基清除率最高达到了84.9%。同时，树上虾丙酮提取物的DPPH自由基清除能力与作用时间有关，且提取物与DPPH自由基的作用非常迅速。此外，本实验研究了树上虾丙酮提取物对羟自由基的清除能力，发现其对羟自由基表现出很好的清除能力。