两种盐酸阿考替胺相关杂质的合成和结构分析

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(天津工业大学 环境与化学工程学院，天津 300387)

盐酸阿考替胺由日本Zeria公司和Astellas公司共同研发[1]，是一种用于治疗功能性消化不良(FD)的新型上消化道(GI)运动调节剂和应激调节剂[2]，国外临床应用广泛，对餐后饱胀、腹胀、早饱等症状具有改善作用[3]。现国内盐酸阿考替胺生产企业较少，主要以原料合成为主。本文作者以2,4,5-三甲氧基苯甲酸为原料，经酰氯化后与氨基噻唑烷基酯缩合，选择性脱甲基化，与二异丙基乙二胺胺解、酸化，得到目标产物[4-7]。在合成盐酸阿考替胺过程中发现，2-[N-(4,5-二甲氧基-2-羟基苯甲酰基)氨基]-4-(烷氧羰基)-1,3-噻唑(Int2)HPLC谱图中主峰后出现未知色谱峰，对盐酸阿考替胺成品检测，未知色谱峰仍可见，测试样品HPLC面积归一化显示，未知杂质表观含量可达0.1%，有必要进行单独控制。

本文针对两种未知杂质，分析了其可能来源，定向合成两种杂质单体，通过UV、IR、MS、NMR、元素分析等手段对其结构进行了表征确认。为下一步提高阿考替胺纯度、控制阿考替胺成品质量提供了有力支持。

1 仪器与试药

嘉鹏ZF-6三用紫外线分析仪；赛默飞Nicolet is50傅立叶红外光谱仪；沃特世E2695高效液相色谱仪；耐驰QMS403C型质谱仪；Bruker 400M型核磁共振仪；Vario EI cube元素分析仪。

甲醇(色谱纯，FISHER)，乙腈(色谱纯，Kermel)，盐酸(分析纯，天津风船)，磷酸(分析纯，阿拉丁)。

2 杂质初步分析

图1 盐酸阿考替胺样品杂质检测HPLC图

Fig.1 HPLC chromatogram of impurity detection of Acotamine hydrochloride sample

目前盐酸阿考替胺合成路线较多，但相关杂质分析表征却鲜有报道。专利[8]介绍了七种杂质的HPLC检测方法，依照专利方法对样品溶液进行测定(图1)，并比较专利附图相关杂质相对保留时间(RRT)，未知杂质并非报道杂质。考虑到未知杂质色谱峰首次出现在Int2检测过程，并结合本文作者合成盐酸阿考替胺路线，2-[N-(2，4，5-三甲氧基苯甲酰基)氨基]-4-(乙氧基羰基)-1,3-噻唑(Int1)选择性脱甲基化制备2-[N-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯甲酰基)氨基]-4-(乙氧基羰基)-1,3-噻唑(Int2)(图2)反应条件：在酸性环境中进行，反应温度超过100℃，回流时间6h，推测未知杂质是由Int1及Int2水解造成。对相同样品进行液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测，同时扫描一级质谱。样品溶液谱图中出现3个主要色谱峰(图3)，其中保留时间为3.09min色谱峰其准分子离子[M+H]+的m/z为451，则相对分子质量为450，与盐酸阿考替胺样品[9]相对分子质量一致；保留时间为3.38色谱峰其准分子离子[M+H]+的m/z为325，则相对分子质量为324，与Int2水解产物相对分子质量一致；保留时间为3.45色谱峰其准分子离子[M+H]+的m/z为339，则相对分子质量为338，与Int1水解产物相对分子质量一致。由此推测杂质产生路线如图4～5，并暂将Int1水解杂质命名为IMPA，Int1水解杂质命名为IMPB。LC-MS测试样品一级质谱图详见图6。

图2 Int1选择性脱甲基化制备Int2

Fig.2 The process of Int1 selective demethylation to prepare Int2

图3 盐酸阿考替胺LC-MS图

图4 IMPA产生过程

图5 IMPB产生过程

图6 盐酸阿考替胺不同保留时间质谱图

3 未知杂质定向合成

3.1 IMPA的合成

向带有搅拌装置的三口瓶中加入20g Int1，80 mL甲醇溶液，油浴搅拌，同时滴加80 mL氢氧化钠溶液(1 moL/L)，滴毕，测试溶液pH值，待Int1全部溶解，搅拌30min，滴加80 mL盐酸溶液(1 mol/L)，继续搅拌1h，静置，待晶体析出减压抽滤，收集晶体50℃鼓风干燥10 h即得IMPA。

3.2 IMPB的合成

将Int2 20g置于三口瓶中，甲醇溶液30mL，油浴搅拌，同时滴加30mL氢氧化钠溶液(1moL/L)，滴毕，测试溶液pH值，搅拌30min，滴加1mol/L盐酸溶液60mL，继续搅拌30min，静置，待晶体析出减压抽滤，收集晶体，50℃鼓风干燥10h即得IMPB。

4 未知杂质结构确认

4.1 UV分析

将IMPA、IMPB配成20 μg/mL溶液，在200～400 nm波长范围内进行紫外分光光度扫描。IMPA及IMPB分别在322 nm、325 nm有较强吸收，为碳氧双键特征峰，在278 nm、279 nm处吸收峰可知分子中存在芳环类结构，224 nm、222 nm处吸收峰为碳氮双键特征峰。

4.2 IR分析(Kbr)

IMPA红外光谱(图7)数据分析：3024、2942、1606 cm-1为甲基吸收峰，2713cm-1为甲氧基的C-H的伸缩振动峰；3308、1661、1551、573、517 cm-1为仲酰胺的伸缩振动和弯曲振动峰；3133、1497、1194、801、728 cm-1为苯环以及取代苯环的伸缩振动峰。IMPB红外光谱(图8)数据分析：2945、1432、2624cm-1为甲基吸收峰，2840cm-1为甲氧基的C-H的伸缩振动峰；3220、1683、1625、609、523cm-1为仲酰胺的伸缩振动和弯曲振动峰；3040、1511、1189、899、735 cm-1为苯环以及取代苯环的伸缩振动峰。

图7 IMPA红外光谱图

图8 IMPB红外光谱图

4.3 元素分析

称取供试样品约2 mg，平行测定两次。IMPA测试数据见表1，IMPB测试数据见表2。

表1 IMPA元素分析测试结果与理论计算值比较

供试样品C、H、N、S实测值与理论计算值误差均小于0.3%，可知IMPA碳、氢、氮、硫元素与理论计算值一致。

表2 IMPB元素分析测试结果与理论计算值比较

供试样品C、H、N、S实测值与计算值误差均小于0.3%，可知IMPB碳、氢、氮、硫元素与理论计算值一致。

4.4 MS分析

将已纯化的Int1、Int2、IMPA和IMPB进行质谱分析(图9)，结果显示相应[M+H]+的m/z为367、339、353、325，则相对分子质量依次为366、338、352、324。表明IMPA及IMPB相对分子质量与推测路线相对分子质量均一致，Int1与IMPA相对分子质量差值及 Int2与IMPB相对分子质量差值均与推测路线差值一致。

图9 杂质和中间体质谱图

4.5 NMR分析

4.5.1 测试条件

取高纯度IMPA、IMPB适量，在DMSO-d6中溶解制成浓度约为40mg/mL溶液，以TMS为内标测试氢谱、碳谱。

4.5.2 IMP A核磁共振氢谱(1HNMR)

1HNMR图谱(图10)出现8组峰(溶剂峰除外)，共14个质子，其积分比为3∶3∶3∶1∶1∶1∶1∶1，与推测分子质子一致。由谱图化学位移值可知：δ3.77ppm,3.89ppm和4.02ppm，单峰，苯环相连三个甲氧基质子(H1，H8，H15)；δ6.84ppm，单峰，为苯环上靠近甲氧基连接碳相邻质子(H1)；δ7.43ppm，单峰，为苯环上羰基连接碳邻位质子(H4)；δ8.02ppm，单峰，噻唑环质子(H11)；δ12.88ppm，单峰，羧基质子(H14)；δ11.52ppm，单峰，酰胺质子(H16)；上述数据表明：供试品结构中存在一个次甲基、三个甲氧基、芳香环、一个酰胺氢和一个羟基氢。

图10 IMPA氢谱

Fig.10 The1HNMR spectrum of IMPA

4.5.3 IMP B核磁共振氢谱(1HNMR)

1HNMR图谱出现8组峰(溶剂峰除外)，共12个质子，其积分比为3∶3∶1∶1∶1∶1∶1∶1，与推测分子质子一致，质谱图见图11。由谱图化学位移值可知：δ3.78ppm和3.85ppm，单峰，苯环相连甲氧基质子(H7，H8)；δ6.61ppm，单峰，为苯环靠近酚羟基连接碳邻位质子(H4)；δ7.62ppm，单峰，为苯环靠近酰胺连接碳邻位质子(H1)；δ8.04ppm，单峰，噻唑环上质子(H11)；δ11.42ppm，单峰，羧基质子(H14)；δ12.34ppm，单峰，酰胺质子(H16)； δ13.34ppm为羟基质子(H15)。上述数据表明：供试品结构中存在一个次甲基、两个甲氧基、芳香环、一个酰胺氢，一个羟基氢、一个酚羟基氢。

图11 IMPB氢谱

4.5.4 IMPA核磁共振个碳谱(1CNMR)

样品图谱(图12)中有14个峰，对应本品分子中14个碳，分子无对称结构。由位移值数据综合分析可知：δ56.54ppm，55.70ppm，57.65ppm，苯环相连甲氧基碳信号(C7，C8，C15)；δ98.28ppm，苯环甲氧基相连碳的邻位碳信号(C1)；δ110.73 ppm，苯环上羰基相连碳信号(C4)；δ113.65 ppm，苯环羰基相连碳邻位碳信号(C5)；δ123.47ppm，噻唑环上S邻位碳信号(C11)；δ142.74ppm噻唑环上N邻位碳信号(C6)；δ143.52ppm，苯环羰基相连碳间位碳信号(C12)；δ154.05ppm，苯环羰基相连碳及甲氧基相连碳共同邻位碳信号(C3)；δ154.44ppm，苯环羰基相连碳对位碳信号(C2)；δ158.21ppm，噻唑环相连羰基碳信号(C10)；δ163.03ppm，噻唑环碳信号(C9)；δ163.73ppm，苯环相连羰基碳信号(C13)。上述数据表明，碳谱中共出现14个碳信号，分别代表3个伯碳、3个叔碳和8个季碳。据此推测，其结构中含有14个碳原子。样品数据与推测分子一致。

图12 IMPA碳谱

4.5.5 IMPB核磁共振个碳谱(1CNMR)

样品图谱(图13)中有14个峰，对应本品分子中14个碳，峰值与碳原子一一对应表明，分子无对称结构。由位移值数据综合分析可知：δ56.37ppm，56.55ppm，苯环相连甲氧基碳信号(C7，C8)；δ101.28ppm，苯环上羟基相连碳的邻位碳信号(C1)；δ105.96ppm，苯环上羰基相连碳信号(C4)；δ111.15ppm，苯环上羰基相连碳邻位碳信号(C5)；δ123.57ppm，噻唑环S邻位碳信号(C11)；δ142.54ppm，噻唑环N邻位碳信号(C12)；δ143.91ppm，苯环上羰基相连碳间位碳信号(C3)；δ155.32ppm，苯环上羟基相连碳信号(C6)；δ155.88ppm，苯环上羰基相连碳对位碳信号(C2)；δ158.51ppm，噻唑环相连羰基碳信号(C10)；δ162.97ppm，噻唑环碳信号(C9)；δ166.47ppm，苯环相连的羰基碳信号(C13)。上述数据表明，碳谱中共出现13个碳信号，分别代表2个伯碳、3个叔碳和8个季碳。据此推测，其结构中含有13个碳原子。样品数据与推测分子一致。

图13 IMPB碳谱

Fig.13 The1CNMR spectrum of IMPB

4.6 结构确认小结

由元素分析可知，IMPA及IMPB样品C、H、N、S测试值与理论值相符，质谱分析离子峰[M+H]+的m/z为353、325，推测IMPA样品分子式为C14H14N2O6S，IMPB样品分子式为C13H12N2O6S。结合UV、IR、NMR分析结果确定IMPA为2-[N-(2,4,5-三甲氧基苯甲酰基)氨基]-4-羧基-1，3-噻唑(IMPA)(图14)；IMPB样品分子为2-[N-(4,5-二甲氧基-2-羟基苯甲酰基)氨基]-4-羧基-1，3-噻唑(IMPB)(图14)。其色谱保留行为与图1一致(图15)。

图14 IMPA及IMPB结构式

Fig.14 The chemical structures of the IMPA and IMPB

图15 盐酸阿考替胺杂质系统适应性HPLC色谱图

5 讨论

盐酸阿考替胺合成过程中会产生多种杂质，包括本文合成IMPA及IMPB。目前盐酸阿考替胺杂质研究报道较少，本文合成杂质为阿考替胺合成关键步骤Int1选择性脱甲基化制备Int2过程中产生，表征确认其结构有利于控制中间产品纯度，亦有助于盐酸阿考替胺成品质量控制，对合成工艺、产品质量提高将有所帮助。