茶多酚冷浸提、热提对比分析及纯度测定

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(安康学院 秦巴中药资源研发中心，陕西 安康 725000)

茶多酚是茶叶中具有强抗氧化作用的多酚类物质的总称，是茶叶活性成分的重要组成部分，约占茶叶干重的15%～25%，具有抗氧化、抗衰老、抗辐射、抑菌等作用，在食品、保健品、化妆品等领域应用广泛[1-2]，市场需求量逐年增加，虽然目前茶多酚的提取纯化等工艺研究报道较多[3-5]，但是以低成本、易操作、高纯度为原则的茶多酚提取纯化工艺的研究是市场发展的持续关注点，仍然具有研究的意义。

茶多酚具有较强的极性，可溶于水和高浓度乙醇，其提取工艺主要是在50℃以上，以蒸馏水或60%～70%的乙醇为溶剂为溶剂[6]，采用超声辅助法[7-9]、微波辅助法[10-11]等方法，对设备要求高，本文采用高浓度乙醇(80%)渗漏提取的冷提取法，从茶叶中提取茶多酚，提取方法简单，设备装置简单，所得提取液，采用二级萃取分离[12-13]和二级柱分离[13-14]相结合的方法纯化，得到的高纯度的茶多酚的粉末。同时，采用直接加热水提的方法做对比实验，从茶叶中提取茶多酚，采用同样的纯化方法，对比冷提和热提的提取液及纯化后茶多酚的纯度的差异，为茶多酚的工业化生产降低生产成本，提高产品纯度提高数据支持，同时茶多酚的冷提纯化过程还可得到少量脂溶性色素作为副产品。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

超声波清洗器KH2200E(超声频率40kHz,超声功率80W，加热功率600W)昆山禾创超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，RE-52AA，上海雅荣生化仪器设备有限公司，傅立叶红外光谱仪FT-IR200美国Nicolet公司，双光束紫外-可见分光光度计，SP-1900，上海光谱仪器有限公司，高效液相色谱SPD-10AVP 日本岛津，玻璃器包括：渗漏器、分液漏斗等。

茶叶为陕西省安康市本地紫阳富硒茶，茶多酚标品购自北京索来宝生物科技有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、溴化钾、甲醇均为分析纯，购自天津市百世化工有限公司，聚酰胺(200-400目)、AB-8大孔吸附树脂购自天津市光复精细化工研究所。

1.2 实验过程

1.2.1 茶多酚的冷浸提取及纯化

取低温烘干后的茶叶10.0 g，粗粉碎(过60目筛)，以料液比为1∶15加入80% 的乙醇溶液150 mL于渗漏器中，浸泡24 h后，收集初漏液125 mL，再添加80% 的乙醇溶液，渗漏速度2 mL/min，收集续漏液50 mL左右，合并两次渗漏液，并定容至200 mL(用做冷提液样品，采用高效液相法测定其中茶多酚含量，见本文结果与讨论部分)。

渗漏液在0.08MPa、50 ℃减压浓缩，回收乙醇，等体积加入二氯甲烷萃取，下层无色液体即萃余相，可从其中得到副产物咖啡因(详细见副产物分离纯化)，上层抹茶色萃取相再用等体积乙酸乙酯萃取两次，上层乙酸乙酯层为浅墨绿色，减压浓缩，0.08MPa、45 ℃下回收乙酸乙酯，浓缩液中含有目标产物茶多酚和脂溶性色素。

用胶头滴管每次吸取少量上述浓缩液，逐滴滴加上聚酰胺树脂柱，柱内保留时间为30 min，先用1.5倍柱体积的去离子水洗脱去除残留咖啡因，再用1.5倍柱体积的85% 的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。

将上述洗脱液用胶头滴管每次吸取少量液体逐滴滴加上AB-8树脂，柱内保留时间30 min，用1.5倍柱体积的85%乙醇溶液洗脱，收集淡黄色洗脱液，0.08MPa、50 ℃减压浓缩回收乙醇，低温烘干，得到茶多酚结晶性粉末1.4618 g，得率14.62%，标记为茶多酚样品1。冷浸提后的滤渣经干燥后称重为6.9125 g。

图1 茶多酚冷提纯化及副产物分离方框流程图

Fig.1 Flow chart of tea polyphenol and by-product from cold extracting solution separation and purification

1.2.2 茶多酚的热提取及纯化

称取10.0 g低温烘干后的茶叶，粗粉碎(过60目筛)，加入250 mL的蒸馏水，80 ℃提取60 min后过滤，滤渣再加入200 mL的蒸馏水80 ℃提取60 min[3]，合并两次滤液，定容至500 mL(用做热提液样品采用高效液相法测定其中茶多酚含量，见本文结果与讨论部分)。

滤液在0.08MPa、75℃下减压浓缩，至50 mL左右，用等体积二氯甲烷萃取，取上层再用等体积乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯0.08MPa、45℃减压浓缩，得到茶多酚的浓缩液，柱分离纯化工艺过程及条件和冷浸提取后茶多酚柱分离纯化方法相同,低温烘干后得到茶多酚结晶性粉末1.0612 g，得率10.61%，标记为茶多酚样品2。热浸提后的滤渣经干燥后称重为5.8608 g。

图2 茶多酚热提纯化方框流程图

Fig.2 Flow chart of tea polyphenol from hot extraction and purification

1.3 茶多酚冷提工艺副产物回收及产量

1.3.1 咖啡因

茶多酚冷提纯化过程中，二氯甲烷层中可回收副产物咖啡因，采取氧化钙升华法[7]，回收得到0.0781 g白色针状咖啡因晶体；茶多酚热提纯化过程中二氯甲烷层，回收得到0.0232 g白色针状咖啡因晶体。

1.3.2 脂溶性色素

茶多酚冷提工艺中，利用茶叶中脂溶性色素易溶于高浓度乙醇微溶于水，不溶于二氯甲烷而易溶于乙酸乙酯的特点，设计冷提取、萃取分离、柱分离相结合方式，从10 g茶叶中得到了副产物脂溶性色素0.5813 g。

1.4 茶多酚的含量/纯度分析

建立高效液相色谱分析方法，对冷提、热提的提取液和纯化后的茶多酚样品的含量/纯度进行分析。高效液相色谱条件：C18色谱柱，柱温25 ℃，紫外检测器，检测波长279 nm，流动相：A：甲醇；B：0.1%磷酸水溶液(A∶B = 28∶72)，流速1.0 mL/min。

标品溶液的制备：精密称取茶多酚标品粉末25.0 mg，于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解后，置于超声条件下30 min，定容，以0.45μm 微孔滤膜滤过，滤液作为样品储备液备用。标准曲线测定，分别取标品储备液1、2、4、6、8、10、12 mL定容至25 mL，取10μL 进样。

样品溶液的制备：冷提液和热提液，各取10 mL，以0.45μm 微孔滤膜滤过，滤液作为样品供试液，取1μL 进样；分别精密称取茶多酚样品1和茶多酚样品2各5.0 mg，于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解后，定容，以0.45μm 微孔滤膜滤过，滤液作为样品供试液，取10μL 进样。

2 结果与讨论

2.1 茶多酚标品的高效液相色谱图及分析

在本实验建立的高效液相条件下，测得茶多酚标品的高效液相色谱图如图3所示，共有7个峰反应了茶多酚的主要组成(数据如表1所示)，采用保留时间定性，面积加和后进行外标法计算含量，茶多酚标准曲线如图4所示，根据标准曲线可得到茶多酚冷提液和茶多酚热提液中茶多酚的含量分别为2.3033 g和1.4740 g。

图3 茶多酚标准品的高效液相色谱图

Fig.3 High performance liquid chromatography of Tea polyphenol standard product

图4 茶多酚标品的标准曲线

2.2 两种提取纯化方法得到的茶多酚纯度对比分析

采用高效液相法对比分析冷提纯化法和热提纯化法中茶多酚的含量及纯度的变化，高效液相图谱如图5～8所示，数据如表1、表2所示。

图5 冷提液的高效液相色谱图

图6 茶多酚样品1的HPLC图谱

样品序号茶多酚冷提液保留时间峰面积含量/%茶多酚样品1保留时间峰面积含量/%12.682487614.9061.52732.698134490.2343.353723.990722312.1882.26103.99048411.1880.867534.407218940.7030.68534.39833666.8130.839746.17310439282.00032.67786.2151643287.87540.977257.9231040041.8133.25567.932323190.0008.059169.523270086.6880.84549.53288377.1092.2038714.0403194991.75010.001214.0981138515.75028.3902总和16373270.0551.25363409938.96984.6912

表2 热提纯化法的高效液相数据

图7 热提液的高效液相色谱图

Fig.7 HPLC of Tea polyphenol hot extracting solution

图8 茶多酚样品2的HPLC图谱

图6和图8对比于图5和图7，经过二级萃取和二级柱分离，杂质峰明显减少且图6和图7和茶多酚标品的HPLC图谱在出峰的个数和位置上对应度高；从表1和表2的数据可看到，茶多酚样品1和茶多酚样品2的纯度分别达到了84.69%和92.02%，纯度提高明显。

3 结论

本文根据茶多酚的理化性质，在茶多酚的提取方法上设计了简单的高浓度乙醇(80%)冷浸渗漏提取的方法(冷提法)，经HPLC法测定，得到的提取液中茶多酚含量达到了2.3033 g(占茶叶总重23.03%)，提取率高，操作方法简单、设备简单，提取液可减压回收乙醇，溶剂循环利用，生产成本低，提取率和提取液的含量均高于常用的加热提取的方法，优势明显。

另外，本文采用了二级萃取和二级柱分离结合的方法进行茶多酚提取液的纯化，冷提法纯化后茶多酚的得率为14.62%，纯度为84.69%，热提法纯化后茶多酚的得率为10.61%，纯度为92.02%。

由于冷提液的颜色是深墨绿色，和热提的颜色区别很大，所以在冷提纯化过程中，除过得到针状咖啡因晶体外，还得到了0.5813 g脂溶性色素作为副产物。