响应面法提取榆干离褶伞多糖的工艺研究

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(鞍山师范学院 化学与生命科学学院，辽宁 鞍山 114007)

蘑菇是自然界中种类繁多、世界分布的生物资源，我国有蘑菇1万余种，同时也是世界上较早应用蘑菇的国家，《神农本草经》和《本草纲目》中记载了蘑菇的药用价值[1]。蘑菇中含有多糖类﹑甾体类、萜类、黄酮类等生物活性物质，药理实验表明，蘑菇多糖具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫、降血脂、抗肝炎等广泛的生物活性，已成为药品和食品行业的开发研究方向[2-4]。榆干离褶伞(Lyophyllum ulmarium)属白蘑科离褶伞属，又名对子蘑、大榆蘑，是一种菌肉肥厚，香味浓郁的食用菌，在我国主要分布在东北三省，并已人工驯化栽培成功，研究者发现，榆干离褶伞发酵液和菌丝体具有抗氧化、保肝、溶栓作用和保护血管内皮细胞等功效[5-7]，而子实体生物活性方面的研究鲜见报道。因此，本文采用超声提取榆干离褶伞中多糖，利用响应面法优化提取条件，旨在为榆干离褶伞开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

榆干离褶伞：2015年购买于吉林安图，由鞍山师范学院化学与生命科学学院张福维教授鉴定为榆干离褶伞(Lyophyllum ulmarium)。

葡萄糖标准品、石油醚、无水乙醇、苯酚、硫酸等试剂均为分析纯：国药集团。

1.2 仪器与设备

Cary50紫外可见分光光度计：美国Varian公司；KQ-700GVDV型三频恒温数控超声波清洗器：江苏省昆山市超声波仪器有限公司；离心机：上海安亭科学仪器厂；电子天平：梅特勒-托利多(上海)有限公司；其他为实验室常用仪器设备。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的处理

榆干离褶伞经过洗净，自然干燥，粉碎，备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

参照文献[8]中的苯酚-硫酸法。

1.3.3 榆干离褶伞多糖的提取及测定

参照文献[9]中的提取与测定法。

1.3.4 单因素试验

准确称取一定量的榆干离褶伞样品超声提取。采用不同的超声时间、超声功率、超声温度、料液比进行提取试验，考察各因素对提取产率的影响。

1.3.5 响应面优化试验

在1.3.4试验基础上，采用四因素三水平的响应面试验方法优化提取工艺，试验数据采用Design Expert 8.0.6软件分析，得到榆干离褶伞多糖提取的最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 超声时间对榆干离褶伞多糖得率的影响

在料液比超声功率440 W、1∶20 (g/mL)、超声温度40 ℃条件下，分别经超声提取15、20、25、30、35min后，分析超声时间对榆干离褶伞多糖得率的影响，如图1所示。

图1 超声时间对多糖得率的影响

由图1可知，榆干离褶伞多糖得率随超声时间的增加，先升高后下降，在30min时最大。原因在于超声时间增加会使体系的温度升高，引起多糖分解[10]，同时考虑超声时间短，也不利于多糖从组织细胞中溶出，因此选取超声时间为25～35min。

2.2 超声功率对榆干离褶伞多糖得率的影响

在超声时间25min、超声温度40 ℃、料液比1∶20 (g/mL)条件下，分别经超声功率380、410、440、470、500 W后，分析超声功率对榆干离褶伞多糖得率的影响，结果如图2所示。

图2 超声功率对多糖得率的影响

从图2可以看出，随着超声功率的增大，多糖得率呈先上升后下降趋势，原因在于超声功率的增加会破坏多糖结构，从而降低多糖得率[11-12]。因此超声功率选择在380～440 W。

2.3 超声温度对榆干离褶伞多糖得率的影响

在超声功率440 W、料液比1∶20 (g/mL)、超声时间25min条件下，分别在温度20、30、40、50、60 ℃提取后，分析超声温度对榆干离褶伞多糖得率的影响，结果如图3所示。

图3 超声温度对多糖得率的影响

从图3可看出，多糖提取率随着超声温度的升高先增加后下降趋势，在50 ℃为最大，原因在于超声温度过高也会破坏多糖的结构[13]。因此超声温度选择在40～60 ℃。

2.4 料液比榆干离褶伞多糖得率的影响

在超声时间25min、超声功率440 W、超声温度40 ℃条件下，分别以料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30提取后，分析料液比对榆干离褶伞多糖得率的影响，结果如图4所示。

图4 料液比对多糖得率的影响

从图4可看出，随着溶剂用量的逐渐增大，多糖得率先升高，在1∶20后再下降，原因是提取溶剂的增加，有利于多糖的溶出，但溶剂量过多会降低热量密度，从而提取率下降[14]，因此料液比选择在1∶15～1∶25。

2.5 榆干离褶伞多糖提取工艺的响应面优化

2.5.1 回归模型的建立

在单因素试验结果基础上，选取超声时间、超声功率、超声温度、料液比4个因素进行响应面分析，试验结果见表1。

表1 试验设计方案与结果

表1(续)

对表1试验结果进行Design-Expert 8.0.6.1软件分析和多元回归拟合，得榆干离褶伞多糖得率对超声时间(A)、超声功率(B)、超声温度(C)和料液比(D)的二次多项式回归模型：

Y=7.78-0.30A+0.032B+0.13C-0.46D-0.082AB+0.16AC-0.36AD+0.055BC-0.083BD-0.22CD-0.22A2-0.39B2-0.054C2-0.77D2

方差分析和系数显著性检验结果见表2。

表2 方差分析及回归系数的显著性检验

注： *代表差异显著(P<0.05)；**代表差异极显著(P<0.01)。

由分析发现一次项A、C、D和二次项A2、B2、D2及交互项AC、AD、CD对多糖得率的影响极显著。同时，表2中模型P<0.0001，极显著，失拟项(P =0.1442>0.05)不显著，说明模型是合理的[15]，由此可见，此种试验方法是可靠的。

2.5.2 响应面交互作用分析与最佳提取条件的确定

方差分析中AB、BC、BD交互作用不显著(P > 0.05)，因此只对AC、AD和CD的交互作用进行回归分析，根据回归方程得出相应的响应面图，如图5所示。

图5 不同因素交互作用对多糖得率影响的响应面图

响应面坡度越陡越显著，说明此因素对榆干离褶伞多糖得率的影响越大，反之则表明影响越小；圆形的等高线表示参数之间交互作用不显著，椭圆形的等高线则相反[16]。由图5可知，两因素交互作用大小为∶ 超声时间和料液比>超声温度和料液比>超声时间和超声温度，与方差分析的结果相吻合。

通过响应面回归分析得出榆干离褶伞多糖最佳提取工艺条件的参数为：超声时间30.21min、超声温度60 ℃、料液比1 ∶17.70、超声功率414.73 W，多糖得率预测值为8.0117%；结合实际条件，选取超声时间30min、超声温度60 ℃、料液比1∶18、超声功率415 W，进行三组重复性实验，多糖得率为7.96%±0.03%，与预测值相近，说明优化模型是可靠的。

3 结论

本研究在单因素超声提取试验的基础上，采用响应面软件优化榆干离褶伞多糖的最佳提取工艺为：超声时间30min、超声温度60 ℃、料液比1∶18、超声功率415 W，多糖得率为7.96%±0.03%，该模型回归显著，对试验拟合程度好，有关榆干离褶伞多糖的活性还有待进一步研究。