中耳胆脂瘤中Rock1和Rock 2的表达研究*

宋少鹏 马秀岚

中耳胆脂瘤是角化的鳞状上皮和上皮下结缔组织以及角蛋白碎片在中耳进行性累积而成，伴或不伴有周围组织的炎性反应[1]。其形成的确切机制尚不清楚，虽然不同的研究已经揭示了中耳胆脂瘤组织的骨质破坏性和过度增殖行为，但关于细胞分化如何影响胆脂瘤生长尚未达成一致意见，有学者认为胆脂瘤上皮存在高分化现象[2, 3]，也有学者认为胆脂瘤上皮的分化受到抑制[4, 5]，因此，有必要对胆脂瘤分化失调进行深入研究。Rho-Rho激酶(Rho/ Rho-associated coiled coil-containing protein kinase,Rho-Rock)信号通路主要对细胞分化、增殖、凋亡和细胞周期进展等方面产生影响[6]。过度增殖、迁移、分化改变等是胆脂瘤的特征，而Rock对这些性质具有很大的影响[7]。Chapman等[8]通过基因表达分析证明Rock抑制剂主要抑制角质细胞分化，在除去Rock抑制剂之后，细胞生长缓慢并且在几次传代后开始衰老，恢复正常分化。本研究拟通过检测中耳胆脂瘤标本中Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled coil-containing protein kinase 1, Rock1 )和Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶2(Rock2 )的表达水平，分析它们之间的相关性，并探究Rock蛋白在胆脂瘤生长过程中的作用。

1 材料与方法

1.1中耳胆脂瘤及正常对照皮肤标本收集 取通过中国医科大学附属盛京医院耳科2017年3月～2017年12月手术的中耳胆脂瘤标本27例(病例组)，其中男15例，女12例；年龄7～83岁，平均41.30±19.25岁，病程2个月～60年；全部患者术前的临床诊断以及术后病理诊断均为胆脂瘤。同时取其中20例行乳突切开+鼓室成形+耳甲腔成形术患者中废弃的外耳道深部皮肤组织为对照组，其中男10例，女10例；年龄13～83岁，平均47.40±15.68岁，病程1年～54年。全部标本行固定包埋处理。

1.2标本染色步骤 ①切片脱蜡，充分水化后，PBS漂洗3 min，3次；②3%H2O2封闭内在过氧化酶，37 ℃温箱条件下孵化30 min；PBS清洗5 min，3次；③抗原修复液I修复30 min，PBS浸泡5 min，3次；④加山羊血清50 μl，37 ℃温箱条件下封闭内在生物素20 min；⑤滴加适当浓度的一抗50 μl/片，4 ℃过夜(至少18 h)；⑥PBS冲洗5 min，3次。滴加二抗50 μl/片，37 ℃ 20分钟；PBS洗5 min，3次；⑦滴加适当体积的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，37 ℃ 20 min；PBS浸泡5 min，3次；⑧DAB着色，镜下控制，蒸馏水中断反应；⑨苏木素复染，梯度酒精脱水。二甲苯透明，中性树胶封固。使用PBS溶液取代一抗作为阴性对照，使用已知的阳性片作为阳性对照，排除非特异性着色。

1.3Rock1及Rock2表达水平判定 镜下观察Rock1及Rock2蛋白着色情况，以细胞质着棕黄色者为阳性细胞。评分方法先按着色程度计分：没有黄色计0分，弱棕黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计为3分；接着使用400×光学显微镜选择5处没有互相重叠的视野，每一个都计算100个细胞，再按着色范围计分：无染色为0分，<20%为1分，21%～50%为2分；>50%为3分，计算每个视野平均得分。将着色强度得分与着色范围得分相乘为最后得分，0～2分者为阴性(-)，3分或以上者为阳性(+)[9]。

1.4统计学方法 使用统计分析软件SPSS 20.0，Rock1和Rock2蛋白在病例组与对照组间的阳性率比较使用χ2检验，Rock1和Rock2蛋白在胆脂瘤中的相关性分析使用Spearman检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Rock1在病例组和对照组中的表达 Rock1蛋白在胆脂瘤上皮细胞的胞质呈强阳性表达，颜色为棕黄色，27例病例组标本中21例阳性，阳性率77.78%；阴性对照无染色。在正常外耳道皮肤中Rock1蛋白呈弱阳性或阴性表达，20例对照组标本中，5例阳性，阳性率25.0%。中耳胆脂瘤组织中Rock1的表达明显高于外耳道皮肤，差异有统计学意义(χ2=12.948，P<0.05)(图1、2)。

2.2Rock2在病例组和对照组中的表达 Rock2在外耳道皮肤细胞的胞质呈强阳性表达，颜色为棕黄色，20例标本中有18例阳性，阳性率达90.0%；阴性对照没有染色。 Rock2在中耳胆脂瘤上皮细胞呈弱阳性或阴性表达，27例胆脂瘤标本中有7例阳性，阳性率25.93%。中耳胆脂瘤组织中Rock2的表达低于对照组，差异有统计学意义(χ2=18.945，P<0.05)(图3、4)。

图1 Rock1在胆脂瘤组织中的阳性表达 (SP法×400)图2 Rock1在外耳道皮肤组织中的阴性表达 (SP法×400)图3 Rock2在胆脂瘤组织中的阴性表达 (SP法×400)图4 Rock2在外耳道皮肤组织中的阳性表达 (SP法×400)

2.3Rock1和Rock2蛋白在胆脂瘤中表达的相关性 中耳胆脂瘤中Rock1和Rock2的表达见表1，通过Spearman检验，Rock1与Rock2在胆脂瘤组织中的表达呈负相关，r=-0.497，P=0.008(P<0.05)；二者在外耳道组织中的表达没有相关性。

表1 中耳胆脂瘤组织中Rock1、Rock2蛋白表达(例)

3 讨论

中耳胆脂瘤的形成是一个复杂的多因素相互作用的病理过程[10]，表观遗传的改变使上皮过度增殖，炎症反应促进胆脂瘤生长且增加上皮的侵袭性，成骨与破骨细胞以及凋亡与抗凋亡蛋白失衡等因素共同参与了胆脂瘤的发生过程。目前关于胆脂瘤发病机制的研究主要集中在细胞过度增殖、凋亡异常和骨质破坏三方面，关于细胞分化对胆脂瘤作用机制的研究国内外报道较少。

RhoA/Rock信号通路在细胞增殖、分化和凋亡中发挥关键作用[11]。Rock属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是第一个被发现的RhoA下游效应分子，含有Rock1和Rock2两种异构体，它们在其整个氨基酸序列中具有65%的同源性，在其激酶域中具有92%的同源性[12]。Rock 的分子结构包括:①氨基端的激酶催化结构域(激酶区); ②中间的卷曲螺旋结构域，此段包含了Rho 蛋白结合区; ③竣基端的PH 结构域和半胱氨酸富集结构域[13]。激活的Rock可促进肌动蛋白聚合与活化，从而调节肌动蛋白的稳定性；也可通过使肌球蛋白磷酸化来改变细胞骨架，进而发挥生物学效应。

Rock通过调节肌动蛋白细胞骨架的多聚化影响细胞极性和形态，从而影响细胞的最终分化[14]。细胞骨架在细胞分化中起关键作用，当加入细胞松弛素D后，细胞骨架解聚，细胞形态改变，促进细胞向脂肪细胞分化[15]。当调控Rock和其下游靶蛋白，扰乱细胞骨架后，会促进过氧化酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的表达，使细胞向脂肪细胞分化[6]。Nobusue等[16]研究发现在细胞中转入RhoA过表达质粒后，RhoA/Rock信号转导通路可使细胞骨架重塑，从而调控脂肪细胞的成脂分化。有学者研究表明RhoA/Rock信号通路可能参与肌动蛋白细胞骨架的组装，细胞形态改变及软骨细胞相关基因的表达，从而介导了骨髓间充质干细胞分化[17]；当用低强度脉冲超声波(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)刺激使细胞形态改变时，该信号通路可促使细胞向成骨细胞分化[18]。

本研究检测了Rock1和Rock2蛋白在中耳胆脂瘤中的含量，并与外耳道皮肤组织中进行比较，发现Rock2蛋白在胆脂瘤中的表达明显低于正常皮肤，与Yesilova等[19]研究一致；而Rock1在胆脂瘤中的表达明显高于正常皮肤，且Rock1和Rock2的表达在中耳胆脂瘤中呈负相关，在外耳道皮肤中却不存在这种关系，推测Rock蛋白在胆脂瘤中的异常表达，可能通过调节肌动蛋白使角质细胞骨架改变，引起角质细胞极性和形态变化，从而影响胆脂瘤角质细胞的分化。虽然Rock的2种亚型Rock1和Rock2共享高度保守的激酶结构域，但它们表现出明显不同的生物学功能，有报道称Rock1敲低可促进角质细胞终末分化，相反，Rock2敲低抑制角质细胞终末分化[20]。胆脂瘤的病理生理学标志主要是细胞过度增殖和角质细胞分化异常[19]，因此，在胆脂瘤角质细胞中，Rock2的表达降低和Rock1表达增高是可能的。

综上所述， Rock1在中耳胆脂瘤上皮细胞中的高表达、Rock2的低表达可能对胆脂瘤角质细胞的分化产生重要影响，本研究为进一步揭示中耳胆脂瘤的发病机制提供了参考依据、调控Rock1和Rock2蛋白的表达，可能为中耳胆脂瘤的预防和治疗提供新的思路。