转录因子在白念珠菌生物膜形成过程中的调控机制

赵晓琴 冯文莉

(山西医科大学第二医院皮肤性病科，太原 030001)

白念珠菌常寄居于人体肠道、呼吸道和女性泌尿生殖道的上皮细胞内，属于人体机会性致病真菌，是医院获得性感染的第4个最主要原因。白念珠菌生存方式包括游离状态和生物膜状态，生物膜是白念珠菌病理生理学一个不可或缺的特征，其最直接的例证就是白念珠菌生物膜形成在医疗器械感染中的作用。生物膜是由酵母细胞、菌丝和细胞外基质组成的复杂联合体[1]。现有的抗真菌药物对游离状态下的白念珠菌有效，但对大多数生物膜状态下的白念珠菌抑制效果较差，这使得基于生物膜感染的治疗成为困扰临床的一大难题。

生物膜是由一组互联的转录因子形成的极其复杂的调控网络所调控。白念珠菌生物膜主要由Nobile等[2]先前发现的转录因子Bcr1 (biofilm and cell wall regulator 1)、Tec1 (transposon enhancement control 1)、Ndt80(yeast meiosis specific transcription factor)、Rob1(Zn(II)2Cys6 transcription factor)、Brg1(GATA-type zinc finger transcription factor)、Efg1(enhanced filamentous growth 1)以及Fox等[3]后来发现的转录因子Flo8(FLOcculation 8)、Rfx2(regulatory factors that bind to the X box 2)等调节。大多数转录因子可正性调节生物膜形成，只有少数如Nrg1 (negative regulator of glucose-controlled genes 1)、Tup1(TMP-UPtake 1)、Rfx2等对生物膜形成产生负性调节的影响。本文主要概述白念珠菌生物膜形成各阶段的主要转录因子，进一步明确白念珠菌生物膜形成的调控机制。

1 白念珠菌黏附的调控

生物膜形成的第一步是细胞黏附。白念珠菌细胞壁是与底物或另一细胞最直接相互作用的结构。其主要由碳水化合物(β-葡聚糖和几丁质)和糖蛋白(黏附素)组成，黏附素参与白念珠菌生物膜的黏附。

1.1 转录因子正性调节黏附

目前主要的黏附素为细胞壁蛋白，如Als家族，Eap1、Hwp1和Rbt1[4]。研究证明各种细胞壁蛋白均受转录因子的调控，其中锌簇转录因子Bcr1在白念珠菌细胞黏附中起主要作用。一方面，Bcr1通过调控下游靶基因ALS1表达促进白念珠菌细胞-底物(硅氧烷)黏附；另一方面，Bcr1通过调控下游靶基因ALS1、ALS3、ECE1和HWP1的表达介导白念珠菌细胞-细胞黏附[5]。Efg1是真菌界独有的APSES转录因子家族成员，可调控下游黏附基因HWP1、ALS1和EAP1表达，促进细胞黏附。而对雷帕霉素敏感的蛋白激酶Tor1通过控制Bcr1和Efg1的活性负性调控白念珠菌细胞-细胞黏附[6]。Tec1是转录调节因子TEA / ATTS家族的一部分，Daniels[7]研究发现，TEC1/TEC1突变体能够在硅氧烷弹性体上黏附，但黏附性略低。另外，Tec1、Efg1、Ndt80和Brg1均可结合ALS1启动子[8]，促进白念珠菌黏附，但均不是黏附阶段的主要调控因子，仅起辅助作用。

1.2 转录因子负性调节黏附

转录因子Rfx2、Sfp1和Zcf32可抑制白念珠菌的细胞黏附。

Hao等[9]研究表明，RFX2缺失突变体在固体培养基上可促进HWP1、ALS3基因表达增加，白念珠菌细胞黏附增加。C2H2转录因子Sfp1，参与核糖体基因的表达，通过Rhb1-TOR-Sfp1-Bcr1/Efg1信号传导途径起作用，Sfp1抑制Bcr1/Efg1介导的ALS1、ALS3和HWP1黏附素基因的表达，进而抑制生物膜的形成[10]。Zcf32是最新发现的Zn(II)2 Cys6双核簇转录因子成员，其通过抑制黏附调节剂Try5和属于Hwp黏附素家族的许多细胞壁蛋白的表达来调节黏附步骤，在ZCF32突变体中观察到属于Hwp家族的黏附素如CHT2、PGA38、RBT5和SAP4高表达[11]，且RBT5在BCR1Δ/BCR1Δ突变体中高度表达可部分弥补生物膜起始缺陷，表明其可能在黏附中发挥作用。

由此可见，正负转录因子对黏附阶段的调控均是基于对靶黏附基因的调控发挥作用的，转录因子可促进或抑制一个或多个黏附基因的表达进而影响白念珠菌的黏附及生物膜的形成，大部分转录因子对黏附阶段的调控与转录因子Bcr1有关。

2 酵母相-菌丝相的转换

菌丝和酵母细胞可以相互转换，缺乏从一种形式转变为另一种形式能力的突变体形成有缺陷的生物膜。白念珠菌菌丝的形成主要受两种信号传导途径控制：环腺苷酸/蛋白激酶A(cAMP-protein kinase A,cAMP/PKA)途径和有丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径。

2.1 促进菌丝发展的因子

cAMP/PKA途径下游发挥作用的转录因子有Efg1、Tec1、Bcr1、Flo8。EFG1高表达可促进菌丝生长。转录因子Tec1位于Efg1下游，受Efg1转录调控，TEC1纯合缺失突变体菌丝发育受阻[12]。而Tec1则控制生物膜调节因子BCR1的表达，BCR1可以促进菌丝相关基因的表达，但不是菌丝生长所必需的。含有LisH结构域的Flo8也是菌丝生长所必需的[13]，Flo8位于Efg1下游，Fox等[3]发现Ndt80和Efg1均可调控Flo8，Flo8对Ndt80、Efg1也有一定制约作用。另外，FLO8Δ/Δ突变体在大鼠体内中心静脉导管模型中形成的生物膜高度缺陷，其毒力也明显减弱。

cAMP/PKA途径上游发挥作用的转录因子是Ndt80，其在真菌中高度保守，NDT80缺失突变体在血清或GlcNAc中显示出菌丝形成缺陷明显，这与Ndt80调节RAS1的表达能力有关[14]。而Sellam等[15]研究发现Ndt80能促进菌丝特异性基因UME6和TEC1的表达促进菌丝生长。Ume6(白念珠菌菌丝发育的关键调节因子)通过Hgc1和Sun41机制增强生物膜形成[16]，缺失Hgc1(细胞周期蛋白相关蛋白)和Sun41(细胞壁糖苷酶)，Ume6介导的生物膜形成减少。另外，在菌丝形成期间NDT80突变体未能下调转录抑制因子Nrg1[15]，这表明Ndt80是白念珠菌形态转换中转录基因激活和抑制所必需的。

MAPK途径中的转录因子有Tec1和GATA型锌簇转录因子Brg1(又称Gat2)，Brg1在Tec1下游起作用，BRG1/BRG1突变体不能在塑料和硅树脂表面形成生物膜，其过表达在Lee's培养基上促进菌丝的生长，而该基因的缺失具有相反的效果。然而，BRG1的失活对GlcNAc诱导的菌丝发育没有明显影响。在全身感染的小鼠模型中，BRG1/BRG1突变体明显减弱其毒力[17]。最近Su等[18]研究发现BRG1表达增加可以抑制NRG1表达，促进菌丝生长。

Glazier等[19]研究表明，Rob1在菌丝形成的起始阶段起作用，并且Tec1、Efg1和Ndt80与ROB1的上游启动子区域结合，它们与ROB1的启动子结合但并不明显影响ROB1表达，表明ROB1的表达依赖于Rob1对其自身表达的自我调节功能。

上述转录因子Tec1、Efg1、Ndt8、Rob1、Brg1、Bcr1与BCR1、TEC1、EFG1、BRG1的上游启动子区域结合，Tec1、Efg1、Ndt80、Rob1与ROB1的上游启动子区域结合，Efg1、Ndt80与NDT80上游启动子区域结合，共同调控菌丝和生物膜发育。另外，参与菌丝生长的转录因子也会影响白念珠菌毒力，白念珠菌生物膜形成及其毒力增加导致白念珠菌耐药更加严重。

2.2 抑制菌丝发展的因子

Nrg1、Rfg1和Tup1是白念珠菌菌丝生长的三个关键转录抑制因子。

Tup1是一种通用的转录抑制因子，必须通过与各种共抑制因子，特别是DNA结合蛋白如Nrg1p的相互作用而进入其作用位点。缺乏TUP1的菌株在酵母相和诱导菌丝的条件下都生长为假菌丝，并且在系统感染小鼠模型中显示毒力减弱[20]。锌簇转录因子Nrg1被认为通过将Tup1募集到靶基因的启动子上起作用，其可抑制BRG1、BCR1的表达抑制菌丝形成，导致生物膜形成减少[21]。NRG1高表达显示阻断酵母相到菌丝相的转变，在小鼠模型中白念珠菌毒力明显减弱。Rfg1是具有HMG抑制结构域的DNA结合蛋白，白念珠菌中RFG1基因的缺失促进菌丝生长，而RFG1的高表达不会在体外或体内抑制菌丝形成[22]。Tup1可通过Nrg1和Rfg1一起或独立抑制菌丝的生长。

3 细胞外基质(ECM)的产生

成熟的白念珠菌生物膜被包裹在ECM中，该基质是糖蛋白，碳水化合物(主要是α-甘露聚糖，β-1,6-葡聚糖多糖及β-1,3-葡聚糖的混合物)，脂质和核酸的混合物。ECM可促进细胞间黏附，减少细胞分散，避免细胞受免疫系统攻击以及抵抗抗真菌药物进入细胞。目前对ECM的调节和产生知之甚少，锌簇转录因子Zap1和Rlm1参与细胞外基质的调控。

RLM1的缺失可通过下调Gsc1(也称为Fks1)β-1,3-葡聚糖合酶亚基来减少基质形成，促进β-1,3-葡聚糖的形成。编码产生基质多糖成分酶的基因突变(参与甘露聚糖合成的ALG11、MNN4-4、MNN9、MNN1、PMR1、VAN1和VRG4，参与β-1,6-葡聚糖合成的BIG1和KRE5，以及参与β-1,3-葡聚糖合成的GSC1)导致基质合成广泛缺陷[23]，这突出了它们在基质和生物膜发展的生产中的关键作用。Zap1为基质β-1,3葡聚糖的负调节剂，敲除ZAP1基因，显示细胞外基质产生增加，其靶标包括直接作用于基质多糖的葡糖淀粉酶(Gca1和Gca2)和起间接起作用的醇脱氢酶(Csh1、Ifd6和Adh5)[24]。

4 细胞分散的调控

白念珠菌生物膜内的细胞分散到环境中是生物膜生命周期中的另一个重要阶段。生物膜中分散的细胞是源自生物膜最顶端的菌丝层的酵母细胞。与浮游细胞相比，这些生物膜分散的酵母细胞显示出黏附性增加，更具有形成生物膜的能力以及在小鼠感染模型中毒力增强[25]。生物膜分散的主要转录因子包括Nrg1、Pes1(也称为Nop7，参与反向形态转变)和Ume6。

NRG1和PES1的高表达增加了生物膜细胞释放的数量，而UME6的高表达减少了分散。PES1作用于NRG1的下游，用于分散细胞的产生，但不影响菌丝形态或生物膜结构，其高表达导致生物膜细胞分散和播散感染增强[26]。此外，研究表明，任何有利于酵母细胞向菌丝转变的因子都可能减少生物膜细胞的分散。分子伴侣Hsp90消耗显著减少了生物膜中分散细胞的数量[27]。Ywp1(酵母细胞壁蛋白1)也对生物膜分散很重要，缺失YWP1导致降低生物膜分散和增加生物膜黏合性[28]。

综上所述，白念珠菌生物膜形成受多种转录因子的调控，某些转录因子影响生物膜形成的多个阶段，如Efg1、Tec1、Bcr1和Rfx2在白念珠菌黏附和菌丝的形成阶段均发挥作用，Ume6、Nrg1在白念珠黏附、菌丝形成和分散中发挥作用。尽管转录因子可能在多个阶段发挥作用，但在某一阶段主要由部分转录因子发挥主要作用，其他转录因子辅助完成该阶段，共同调控生物膜的形成。目前对白念珠菌生物膜转录调控以及抗真菌药靶点的研究以黏附和菌丝形成阶段多见，对于成熟生物膜的后续发展，细胞外基质的形成，酵母细胞分散的研究较少，因此未来可能会集中于对生物膜形成后面两个阶段的研究，以期为治疗白念珠菌耐药寻找更多的靶点。