富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性的影响

项海东，田松波，陈惠珍

（河北医科大学第二医院 口腔内科，河北 石家庄 050000）

牙髓干细胞（dental pulp stem cells, DPSCs）来自于成年机体的牙髓组织，是具有多向分化潜能和自我更新的未分化细胞。正常情况下，DPSCs处于静息状态，维持牙髓中细胞的功能及新旧交替的稳态，当牙髓中的成牙本质细胞受到损伤后，DPSCs可参与牙髓的修复与重建。因此，DPSCs被认为是影响牙髓牙本质复合体形成的理想种子细胞[1-2]。目前已发现多种在体内及体外影响DPSCs增殖及分化的因素。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin, PRF）是新一代的血小板浓缩制品，富含血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子等多种生长因子，这些因子可构成强大的组织修复功能调节系统，目前已被应用于基础细胞的研究[3-4]。但PRF对DPSCs的影响及机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨PRF对DPSCs的增殖、分化、凋亡的影响及机制，以期为牙髓再生带来新的契机。

1 资料与方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国Gibco公司，磷酸盐缓冲溶液（PBS）、青链霉素购自美国Sigma公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）试剂盒、细胞计数试剂盒（cell counting Kit-8,CCK8）、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫/碘化丙锭（propidium iodide, PI）凋亡试剂盒均购自中国碧云天生物技术研究所，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved Caspase-3）、p38、p-p38单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗均购自美国abcam公司，实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒、逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，Trizol购自美国Invitrogen公司。RT-PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，CO2细胞培养箱购自美国SIM公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，酶标仪、电泳凝胶图像分析系统、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 人牙髓干细胞（hDPSCs）的分离培养

收集河北医科大学第二医院口腔科志愿者（16～25岁）阻生第3磨牙，即刻放入预冷及加入青链霉素双抗的α-MEM培养基中培养保存。无菌条件下取出牙髓组织，用0.01 mol/L的PBS清洗2次，小剪刀将牙髓组织剪成1～2 mm的小组织块，按照1∶1比例加入0.4%的分散酶和0.3%的Ⅰ型胶原酶，37℃消化1 h，轻轻吹打离散单细胞团块，过70 μm的细胞筛网，1 000 r/min离心5 min，0.01 mol/L的PBS清洗1遍。细胞沉淀用高糖DMEM培养基（含20%的胎牛血清）重悬，以1×105个/ml密度接种于细胞培养瓶中，置于37℃，5% CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养。每3天换液1次，细胞生长密度达到80%～90%时，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后传代。收集生长至对数期的第2代hDPSCs进行纯化后再用于后续的实验研究。

1.3 PRF的制备

血液来自河北医科大学第二医院口腔科10例健康的志愿者，平均26岁（22～28岁），均签署知情同意书。无菌条件下每个志愿者抽取5 ml静脉血于真空管中，3 000 r/min离心10 min，静置数分钟后，弃去上清，收集中间层（中间层为PRF），将PRF凝胶与试管底部的红细胞分离出来，所获得的PRF膜用来制备渗出液。将PRF膜放置在预先盛有2 ml/孔的DMEM培养基的6孔板中，1孔/板，培养板置于孵育箱中继续孵育，4℃放置7 d后收集6孔板中的培养液，3 000 r/min离心15 min以沉淀红血细胞，然后使用0.22 μm的无菌滤器过滤除菌。将收集的PRF浸出液分装，置于-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.4 细胞增殖检测

hDPSCs随机分为对照组及实验组。将第3代hDPSCs以1×104个/孔接种于6孔细胞培养板中，37℃，5% CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养。培养第1、3、5及7天时，每孔细胞中加入10 μl的CCK-8溶液，置于37℃，5% CO2培养箱孵育2 h，酶标仪在490 nm波长处测定并记录各组的光密度（OD）值。计算细胞存活率，细胞存活率=（实验组A/对照组A）×100%。

1.5 碱性磷酸酶（ALP）活性检测

hDPSCs随机分为对照组及实验组。每组设置第 0、3、7、14天4个时间点。以2×104个/ml的密度将生长至对数期的第4代hDPSCs的单细胞悬液接种于6孔细胞培养板中，置于37℃，5% CO2培养箱中培养至相应时间后，用Trizol法提取细胞中的总RNA，以逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，以GAPDH作为内参，RT-PCR检测ALP的mRNA表达。ALP引物序列：正向：5'-GGCTGGA GATGGACAAGTTC-3'，反向：5'-CTCGTTTCCCTGAGT CGTGT-3'；GAPDH引物序列：正向：5'-AAGAGTGGG TTTAAGTGGAAGGCT-3'，反向：5'-GAAGATGGTGAT GGGATTTC-3'。PCR反应参数：A，预变性 95℃10 min；B，变性95℃ 10 s；退火60℃ 15 s，延伸72℃ 20 s，共40个循环；C，72℃ 15 min。4℃终止反应。每个样品设置3个重复，取均值采用2-△△Ct法对数据进行相对定量分析。

1.6 细胞凋亡检测

收集按照上述分组培养第7天的细胞，预冷的PBS及结合缓冲液各洗涤细胞1次后，离心弃上清，加入400 μl的结合缓冲液重悬细胞，细胞沉淀加入5 μl的PI和Annexin-V-FITC，充分混匀后置于室温下避光孵育10～15 min，离心沉淀细胞，缓冲液洗涤细胞1次，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 Western blotting检 测 Cleaved Caspase-3、p38、p-p38蛋白表达

收集按照上述分组培养第7天的细胞，按照细胞蛋白提取试剂盒提取细胞中的蛋白，BCA试剂盒检测提取的蛋白质量。将蛋白样品与上样缓冲液等量混匀后置于100℃变性10 min，依次进行聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、封闭、一抗孵育Cleaved Caspase-3、p38、p-p38 1∶400稀释，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH），1∶1 000稀释、二抗孵育辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀释，37℃孵育1 h，洗膜3次，ECL发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH作为内参，分析Cleaved Caspase-3、p38、p-p38的蛋白表达水平。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，两组多时间点的比较采用重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PFR对hDPSCs增殖的影响

对照组在第0、1、3、5及7天的OD值分别为（0.18±0.04）、（0.25±0.06）、（0.36±0.07）、（0.48±0.08）、（0.63±0.09），实验组在第 0、1、3、5 及 7 天的 OD 值分别为（0.20±0.05）、（0.28±0.07）、（0.59±0.08）、（0.73±0.09）、（0.90±0.08）。对照组与PRF组第0、1、3、5及7天的OD值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD值有差异（F=13.243，P=0.000）；②对照组与PRF组OD值有差异（F=17.276，P=0.000）；③对照组与PRF组OD值变化趋势有差异（F=19.417，P=0.000）。见图1。

图1 PFR对hDPSCs增殖的影响 （±s）

2.2 PFR对hDPSCs矿化相关基因ALP表达的影响

对照组在第0、3、7及14天ALP mRNA表达分别为（0.883±0.112）、（1.231±0.163）、（1.624±0.152）、（1.913±0.164），实验组分别为（0.925±0.144）、（1.284±0.192）、（2.422±0.321）、（2.695±0.371），两组第 0、3、7及14天ALP mRNA表达比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间ALP mRNA表达有差异（F=17.191，P=0.000）；②两组ALP mRNA表达有差异（F=19.841，P=0.000）；③两组ALP mRNA表达变化趋势有差异（F=18.358，P=0.000）。见图2。

图2 PFR对hDPSCs的ALP mRNA表达的影响 （±s）

2.3 PFR对hDPSCs凋亡的影响

实验组细胞的凋亡率（4.18±0.67）%较对照组（13.21±1.02）% 下降（t=12.816，P=0.000）。见图 3。

图3 PFR对hDPSCs凋亡的影响

2.4 PFR对Cleaved Caspase-3、p38、p-p38蛋白表达的影响

对照组Cleaved Caspase-3、p38、p-p38的蛋白表达分别为（0.162±0.023）、（0.668±0.046）、（0.041±0.016），实验组Cleaved Caspase-3、p38、p-p38的蛋白表达分别为（0.063±0.016）、（0.681±0.051）、（0.174±0.019），实验组Cleaved Caspase-3蛋白表达较对照组下调（t=0.120，P=0.004）、p-p38蛋白表达上调（t=9.274，P=0.001），p38蛋白在两组间比较差异无统计学意义（t=0.328，P=0.760）。见图 4。

图4 PFR对Cleaved Caspase-3、p38、p-p38蛋白表达的影响

3 讨论

近些年来，利用干细胞治疗已成为再生医学研究的热点[5]。干细胞可分为成体干细胞和胚胎干细胞。DPSCs是成体干细胞的一员，可分化为脂肪干细胞和神经干细胞，也可形成牙本质牙髓细胞。牙本质牙髓细胞是未来牙形成的第一步，这也说明DPSCs在活髓的保存及治疗中有临床应用价值及潜在的优势[5]。PRF是继富血小板血浆（platelet rich plasma, PRP）后的新一代血小板浓缩制品，富含纤维蛋白原、多种生长因子及高浓度的血小板，可诱导内皮细胞、成骨细胞等的增殖、分化等过程[6]。研究显示，PRF可在体外促进牙槽骨成骨细胞的增殖及分化，可以不同的方式促进犬DPSCs的增殖及分化[7-8]。ALP是一种磷酸单酯水解酶，是成骨细胞成熟的早期标志物之一，参与骨的形成及代谢过程，其活性的增强是DPSCs向成牙本质细胞分化的早期标志[9]。本研究结果显示，PRF可促进DPSCs的增殖和分化。

细胞凋亡过程受到Caspase家族的调控，Caspase-3是Caspase家族的一员，是细胞凋亡通路中关键性的活化酶，处在Caspase级联反应的下游，其激活可导致细胞的凋亡[10]。研究显示，Caspase-3的激活可引起DPSCs的凋亡[11]。本研究结果显示，PRF可抑制DPSCs的凋亡及下调Cleaved Caspase-3蛋白表达。

丝裂原活性蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）属于丝蛋白/苏氨酸激酶，参与细胞的增殖及死亡、基因表达调控等过程，在多种信号的传递过程中有重要作用[12]。p38 MAPK信号通路是MAPK信号通路家族中重要一员，参与牙髓干细胞向成牙本质细胞分化等过程[13]。研究显示，阿司匹林可通过抑制p38 MAPK信号通路抑制DPSCs的增殖及分化[14]。p38 MAPK信号通路抑制剂可抑制ALP的活性和成牙本质样细胞的分化，在初期牙本质及第3期反应性牙本质形成过程中，可发现p38 MAPK信号通路的激活[15]。本研究结果显示，PRF可上调p-p38蛋白的表达。

综上所述，PRF可通过激活p38信号通路促进hDPSCs的增殖，上调ALP mRNA表达，抑制其凋亡。该研究为牙髓损伤修复及再生带来了新的思路。