siRNA干扰DNALI1基因对HEK-293细胞增殖与迁移的影响

崔勇 刘功振

摘要：文章探讨了siRNA干扰DNALI1基因对HEK-293细胞增殖、迁移的影响。通过培养HEK-293细胞株，分别转染siRNA DNALI1组（DNALI1-homo-66组、DNALI1-homo-426组与DNALI1-homo-777组）和对照组。siRNA DNALI1组细胞中DNALI1 mRNA表达量均低于对照组，三个干扰组中DNALI1-homo-66组干扰效率最高，差异均具有统计学意义（P<0.05）;与阳性对照组和阴性对照组相比，siRNA DNALI1组细胞转染24—48h细胞增殖能力明显减弱，差异均具有统计学意义（P<0.05）。在细胞水平可通过RNA干扰特异性抑制DNALI1基因来抑制细胞的增殖和迁移能力，为研究DNALI1基因在细胞中的作用机制奠定了基础。

关键词：DNALI1;RNAi;Real-Time PCR;增殖;侵袭

中图分类号：G642.0     文献标志码：A     文章编号：1674-9324（2019）50-0061-02

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指内源性或外源性双链RNA（double strands RNA，dsRNA）与细胞内的同源序列mRNA相结合并使之降解的现象，是一种序列特异转录后的基因沉默机制，其作用相当于基因敲除[1-3]。与传统的基因敲除技术相比，RNAi以其高特异性、高效性、操作简单等显著优势成为研究基因功能的全新手段，其在基因组研究、毒病性疾病治疗、肿瘤治疗、自身免疫性疾病治疗及生物医药开发领域有着广阔的应用前景。本研究通过构建针对DALI1基因的shRNA干扰表达载体，研究DNALI1基因干扰后对HEK-293细胞分裂增殖、迁移的影响。

一、实验方法

1.细胞培养和转染。转染前一天，将4-5×104细胞接种在24孔板上，加入0.5ml含FBS和抗生素，等细胞达到转染密度加入siRNA及lipofectamin2000（invitrogen）试剂柔和混匀，室温放置5min，形成siRNA/lipofectamin2000复合物。将100μl复合物加到含有细胞培养基的24孔板上来回轻柔摇晃。在CO2培养箱中以37℃温育24—48h后，进行转染后的其他检测步骤。

2.荧光定量PCR检测。提取RNA并进行反转录，根据操作将提取好的RNA，根据反转录反应体系配制混合液，充分混匀，42℃，孵育15min;95℃，孵育3min之后放于低温保存，然后建立Real-Time PCR反应体系，反应条件如下：预变性95℃，15min;变性95℃，10sec;退火延伸60℃，30sec，共40个循环。从GenBank上获得DNALI1基因序列，按照shRNA设计原则，针对DNALI1基因序列保守区域各筛选设计、合成3条干扰靶序列，分别命名为DNALI1-homo-66、DNALI1-homo-426、DNALI1-homo-777，同时设计各个对照组（si-NC）、（si-FAM）及（si-GAPDH）。

3.CCK8法检测细胞增殖实验。取转染完毕的细胞，在96孔板中加100μl含3×103个靶细胞悬液，在37℃5%CO2的培养箱培养1—7天，每孔加10μl CCK8染液培养2h;用酶标仪检测450nm波长下每孔的吸光度值;以吸光度值对时间作图，绘制细胞增殖曲线。

4.Transwell小室检测细胞迁移试验。选择siRNA有效干扰靶点DNALI1的siRNA-66细胞和对照组细胞进行培养，取对数期的转染siRNA的细胞，常规消化、离心弃上清，加无血清培养基重悬细胞，制备单细胞悬液，密度调整为5×105个细胞/ml。向每个上室中加200μl细胞悬液（含1×105个细胞），沿着下室内壁加700μl 10% FBS DMEM 700ul。细胞培养箱中孵育16h。取出Transwell小室，甲醇中固定15min，PBS洗3次，放入0.2%的结晶紫染液染色20min，PBS洗3次，显微镜下观察拍照。

二、结果

1.不同组别干扰效率比较。转染细胞24h后，siRNA DNALI1组细胞中DNALI1 mRNA表达量均低于对照组，三个干扰组中DNALI1-homo-66组干扰效率最高，差异均具有统计学意义（P<0.05）;试验结果发现DNALI1-siRNA-66在24h干扰效果最好。转染细胞48h后，DNALI1-homo-66組仍然保持最高干扰效率，差异均具有统计学意义（P<0.05）;试验结果发现DNALI1-siRNA-66在48h干扰效果最好。

2.不同转染组细胞侵袭能力情况比较。通过Transwell试验研究干扰细胞后运动能力的变化，与对照组相比，RNAi DNALI1细胞株运动能力减弱。siRNA DNALI1组细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均低于阳性对照组和阴性对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）（见下图）。

三、讨论

轴丝动力蛋白（Axonemal dynein light intermediate polypeptide 1，DNALI1）是纤毛或鞭毛中组成外周二联丝侧臂的蛋白质，是外周二联丝相互滑动的动力来源。基因敲除轴丝动力蛋白能导致失去纤毛动力，引起男性不育症和大脑侧化缺陷。DNALI1基因定位在4号染色体，包括6个外显子，其在睾丸组织内大量高效表达，集中在精子细胞和精母细胞，而在其他组织中低水平表达。作为一个轴丝动力蛋白，DNALI1主要定位在气管纤毛部位和精子，鞭毛部位提供相互滑动的动力来源[4]。

本研究通过培养HEK-293细胞株，分别转染siRNA DNALI1组和对照组，实时荧光定量PCR技术检测各转染组细胞中DNALI1的基因表达，siRNA DNALI1组细胞中DNALI1 mRNA表达量均低于对照组，三个干扰组中DNALI1-homo-66组干扰效率最高，差异均具有统计学意义（P<0.05），而且siRNA DNALI1组在细胞转染24—48h细胞增殖能力明显减弱，差异均具有统计学意义（P<0.05）;Transwell小室检测细胞迁移能力，结果发现siRNA DNALI1组迁移细胞数均低于对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。因此，在细胞水平可以通过RNA干扰特异性抑制DNALI1基因来抑制细胞的增殖和侵袭力，为研究DNALI1基因在细胞增殖和迁移的作用机制奠定基础。

参考文献：

[1]SINHA SK.RNAi induced gene silencing in crop improvement[J].Physiol Mol Biol Plants，2010，16（4）：321-332.

[2]ELBASHIR SM，HARBORTH J，LENDECKEL W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature，2001，411（6836）：494-498.

[3]IBA？觡EZ-TALLON I，GOROKHOVA S，et al.Loss of function of axonemal dynein Mdnah5 causes primary ciliary dyskinesia and hydrocephalus[J].Hum Mol Genet，2002，（11）：715-721.

[4]RASHID S，BRECKLE R，HUPE M，et al.The murine Dnali1 gene encodes a flagellar protein that interacts with the cytoplasmic dynein heavy chain 1[J].Mol Reprod Dev，2006，（73）：784-794.