肾安冲剂对阿霉素肾病综合征大鼠Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的影响

符逢春 ，林 辉 ，刘 彬 ，毛以林 ，瞿晓林

（1.湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是由许多疾病引起的，以肾小球基底膜通透性增加而发生的一组临床症候群，主要表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高度水肿、高脂血症。随着病情的发展，可导致肾小球硬化和肾间质纤维化，逐渐发展为终末期肾衰竭。研究NS发病机制和干预比较理想的动物是阿霉素肾病综合征大鼠，同时也是探讨药物治疗机制的很好的实验［1］。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度积累是NS肾小球硬化的重要标志，其中ECM的主要成分纤维连接蛋白（fibronectin，FN）和Ⅳ型胶原（collagen typeⅣ，Ⅳ-C）的含量明显增加，肾小球内Ⅳ-C、FN的含量可直接反映肾小球硬化的程度［2］。本研究利用阿霉素肾病综合征大鼠模型，采用免疫组化技术观察肾安冲剂对该模型大鼠肾脏Ⅳ-C和FN表达的影响，为延缓肾小球硬化和肾间质纤维化的中医药治疗提供客观的实验及临床依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物 Ⅳ-C、FN免疫组化检测试剂盒和DAB显色剂，由武汉博士德生物工程有限公司提供；泼尼松片由昆明制药集团有限公司生产；盐酸阿霉素（多柔比星）由法玛西亚普强有限公司生产；肾安冲剂由党参、生黄芪、白术、山药、芡实、升麻、柴胡、仙茅、淫羊藿、当归、丹参、凤尾草、山楂、甘草组成，由湖南中医药高等专科学校附属第一医院药剂科制作（8 g／包）。

1.2 动物 SD雄性大鼠72只，体重（250±20）g，中南大学实验动物学部提供，许可证号：SCXK（湘）2014－0002，饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF级动物饲养室。

1.3 实验动物分组及给药方法 SD雄性大鼠72只随机分为造模组共60只和正常对照组12只。阿霉素肾病综合征大鼠模型的制作：依据文献［3］，结合预试验，造模组分两次注射盐酸阿霉素，第一天用阿霉素5 mg／kg注射于SD大鼠尾静脉内，1周后再次注射阿霉素2 mg／kg于SD大鼠尾静脉内，正常组也尾静脉注射相应生理盐水两次。造模组大鼠再分为肾安冲剂大剂量组、中剂量组、小剂量组，模型组和泼尼松组，每组12只。各治疗组从注射阿霉素2次后第2天起，每天早上8时一次性灌胃给药，连续给药8周。各组给药剂量按人和大鼠体表面积换算法计算，肾安冲剂大剂量组、中剂量组和小剂量组分别灌服肾安冲剂 10.32 g／（kg·d）、5.16 g／（kg·d）、2.58 g／（kg·d）， 模型组灌服蒸馏水 2 mL／d，泼尼松组灌服泼尼松 6.45 mg／（kg·d），正常对照组灌服生理盐水2 mL／d。

1.4 Ⅳ-C和FN的分布及检测 采用免疫组化法。治疗8周后处死大鼠，取肾脏石蜡切片，常规脱蜡至水，采用SABC法检测肾组织中的Ⅳ-C和FN。10%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，用枸橼酸盐（pH＝6.0）微波修复；2%BSA封闭20 min。加一抗（FN，1∶100；Ⅳ-C，1∶100）37℃ 1 h，PBS（pH 7.2～7.6）洗3次；加二抗生物素化山羊抗小鼠IgG37℃ 20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗 3 次；加 SABC 复合物液孵育 20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗 4 次；DAB 显色，苏木红复染，每次染色均以PBS代替一抗作阴性对照。显微镜下观察并摄片，结果以细胞膜和细胞外基质中出现明显的棕黄色反应为阳性。

1.5 结果判定 采用双盲进行分析，每组切片随机选取5个视野，用MIAS医学图像分析系统扫描进行统计分析，测量每一视野的阳性目标染色区域的平均灰度，取其平均数作定量分析。

1.6 统计学方法 用SPSS18.0软件进行统计学分析。计量资料属正态分布以（）表示，多组样本间比较用F检验，组间比较用q检验。

2 结 果

2.1 6组Ⅳ-C和FN表达的平均灰度比较 见表1。用低倍显微镜和高倍显微镜下观察切片，镜下可见阳性细胞结构清晰，细胞浆内有棕黄色颗粒沉着，颗粒染色显著高于背景。实验过程中肾安冲剂小剂量组、中剂量组、大剂量组，模型组，泼尼松组分别有 4、3、2、2、3只大鼠死亡，均是由灌胃而导致死亡。

表1 6组Ⅳ-C和FN表达的平均灰度比较（）

表1 6组Ⅳ-C和FN表达的平均灰度比较（）

注：与模型组比较，1）P＜0.01；与肾安冲剂大剂量组比较，2） P＜0.01。

FN 87.23±11.341）171.64±13.06 142.62±13.381）2）131.37±21.701）2）112.16±13.041）144.81±16.671）2）组别正常对照组模型组肾安冲剂小剂量组肾安冲剂中剂量组肾安冲剂大剂量组泼尼松组n 12 9 8 9 1 0 9Ⅳ-C 80.07±14.91）154.5±18.4 132.6±15.61）2）123.6±18.51）2）102.7±22.01）128.0±14.01）2）

与模型组比较，各治疗组肾脏Ⅳ-C和FN表达均明显降低，说明肾安冲剂和泼尼松均有降低Ⅳ-C和FN表达的作用，而以肾安冲剂大剂量组疗效最好。

2.2 Ⅳ-C表达的光镜观察 见图1。正常对照组的阳性表达细胞极少，偶见阳性细胞的棕黄色颗粒，且染色较浅；模型组的阳性表达以棕黄色颗粒较多，且阳性细胞的棕黄色颗粒均较深，阳性表达以肾小球基底膜及肾小球系膜区较强；各治疗组均可在一定程度上减轻阳性细胞的表达，肾安冲剂大剂量组的肾小球基底膜有少量细胞呈阳性表达，明显比模型组少，阳性细胞的棕黄色颗粒染色深浅均匀，优于泼尼松组、肾安冲剂小剂量组和肾安冲剂中剂量组。

2.3 FN表达的光镜观察 见图2。正常对照组的阳性表达细胞极少，偶见阳性细胞的棕黄色颗粒，且染色较浅；模型组的阳性表达以棕黄色颗粒较多，且阳性细胞的棕黄色颗粒均较深，于肾小球系膜细胞、血管内皮细胞及少量肾小管上皮胞浆均可见；各治疗组均可在一定程度上减轻阳性细胞的表达，肾安冲剂大剂量组有少量细胞呈阳性表达，明显比模型组少，阳性细胞的棕黄色颗粒染色深浅均匀，优于泼尼松组、肾安冲剂小剂量组和肾安冲剂中剂量组。

图1 各组肾脏Ⅳ-C表达比较（×400）

图2 各组肾脏FN表达比较（×400）

3 讨 论

肾病综合征属中医学的水肿范畴，为本虚标实证，其病机为虚、壅、漏，虚以脾肾气阳亏虚为主，壅主要是水湿和瘀血，漏则表现为大量蛋白尿。肾安冲剂据此研制而成，方用生黄芪、淫羊藿温补脾肾，益气温阳为君药；仙茅助淫羊藿温肾补阳，白术、党参助生黄芪益气健脾，芡实、山药补脾益肾，共为臣药；丹参、当归、山楂活血化瘀为佐药；柴胡、升麻升提清气，凤尾草引湿浊由下而出，甘草调和诸药。前期的研究表明肾安冲剂可降低肾病综合征患者的血脂、尿蛋白，升高血浆白蛋白，明显改善肾功能，对肾病综合征治疗有效［4-5］。

Ⅳ-C是肾小球基底膜网状结构的主要成分，在肾纤维化的进展中，随着肾脏疾病发展，细胞外基质积聚增多跟Ⅳ-C的合成和分泌增多及降解减少有关，最终发展为肾小球硬化和间质纤维化［6］。有研究显示肾小球纤维化过程中Ⅳ-C合成增加［7］。FN可激活炎症细胞，最终促使肾间质的纤维化［8］。薛痕等［9］研究发现肾间质纤维化动物模型肾间质FN的表达增加，并随时间递增，而且与间质相对面积成正相关。也有研究表明无论是免疫性还是非免疫性损伤引起的肾小球硬化过程中，FN的变化都发生较早且明显［10］。

本研究表明肾安冲剂可降低阿霉素肾病综合征大鼠肾组织Ⅳ-C和FN的表达，从而可延缓该模型大鼠进展为肾纤维化，为中医药抗肾纤维化提供了客观的实验依据。