石斛合剂对db／db小鼠糖尿病肾病水代谢的调节

郑燕芳 ，张捷平 ，余文珍 ，王晓宁 ，陈 勇 ，林晓晖 ，牛朋纳 ，李长征 ，林 凡 ，林自生 ，施 红 （.福建中医药大学药学院，福建 福州 50；.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 50；.福清市妇幼保健院，福建 福清 5000）

糖尿病肾病是由糖尿病微血管病变引起的严重并发症之一，是目前糖尿病致死致残的主要原因。本课题组的前期研究表明，降糖中药复方石斛合剂可以改善糖尿病病人和高脂高糖饮食联合链脲佐菌素诱发糖尿病大鼠的糖脂代谢紊乱［1］。水代谢紊乱是糖尿病肾病的重要病理特点，为了探讨石斛合剂防治糖尿病肾病的部份机制，我们选用自发性糖尿病肾病动物模型db／db小鼠作为研究对象，从调节水代谢角度初步探讨石斛合剂防治糖尿病肾病的可能。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验中采用的 db／db（C57BL／KsJ）小鼠是瘦素受体点突变导致瘦素信号通路障碍，从而导致小鼠出现肥胖、胰岛素抵抗、高血糖、脂肪肝等症状。db／db小鼠出生后6周即可出现明显的肥胖和空腹血糖增加，饮水量、尿量增加，8～12周时最明显，并可出现糖尿病肾病等并发症。db／db小鼠通常以db／m小鼠作为实验的对照组。选取db／db 小鼠 32 只，SPF 级，体质量平均为（42.6±3.1）g；db／m 小鼠 8 只，体质量平均为（24.2±1.4）g。 所有小鼠均为雄性，11～12周龄，由北京大学（医学部）实验动物科学部提供，许可证号为SCXK（京）2011-0012，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级环境。实验期间，普通饲料喂养，自由饮食进水，环境条件为温度22～25℃，空气流通，相对湿度60%～70%，12 h光照维持，昼夜循环。

1.2 药物、试剂及仪器 石斛合剂（石斛、黄芪、丹参、葛根、五味子、生地黄、川牛膝、知母、地龙、白花蛇舌草等），六味地黄丸（熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻）购自福建中医药大学国医堂，本实验室采用水提醇沉法制备，浓缩成1.2 g生药／mL的药液。

BCA蛋白测定试剂盒购自杭州碧云天生物技术有限公司，AQP2、AQP3兔抗鼠一抗和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。电泳仪、BIO-RAD凝胶成像仪购自美国伯乐公司。

1.3 实验方法 db／db小鼠适应性喂养1周后，按空腹血糖（FBG）及体质量分成4组，分别为模型组、石斛合剂低剂量组和高剂量组、六味地黄丸组、每组8只。另取同周龄表现正常的db／m小鼠8只为正常组。以上各组动物分别灌胃给药，正常组和模型组小鼠给予生理盐水 20 mL／（kg／d），六味地黄丸组给予六味地黄丸 20 g／（kg·d），石斛合剂低剂量组和高剂量组分别给予石斛合剂6 g／（kg／d）、12 g／（kg／d）灌胃，每天 1 次，连续给药 8 周。

1.3.1 血清学指标测定 干预第0周、4周、8周，采用割尾法取血，以鱼跃（悦好I型）血糖仪快测各组空腹血糖（FBG）；干预8周后，摘眼球采血，分离血清，采用酶法测定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。

1.3.2 肾组织病理变化 干预8周后，处死小鼠，取左侧肾脏标本，按常规方法固定、脱水、包埋，切片厚5 μm，HE染色后于显微镜下观察肾组织的病理变化。

1.3.3 免疫荧光法检测肾组织中的AQP2、AQP3的蛋白表达 1.2.3中制备的肾脏标本切片后，采用免疫荧光法检测肾组织中的AQP2、AQP3的蛋白表达情况。

1.3.4 Western Blot检测肾组织中的 AQP2、AQP3的蛋白表达 各组小鼠的右侧肾脏标本进行总蛋白提取，采用BCA法测定蛋白浓度，变性电泳后转移至PVDF膜后，分别加一抗（AQP2，AQP3兔抗鼠抗体1∶200）、二抗（辣根过氧化物酶标记山羊抗兔1∶2000），用 ECL 发光、显影，最后用 BIO－RAD 凝胶成像仪测定条带的光密度。

1.3.5 统计学处理 数据采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料属于正态分布的用单因素方差分析，非正态分布的用秩和检验。

2 结 果

2.1 干预前后各组F BG变化比较 见表1。

表1 干预前后各组FBG变化比较（）mmol／L

表1 干预前后各组FBG变化比较（）mmol／L

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

组别正常组模型组石斛合剂低剂量组石斛合剂高剂量组六味地黄丸组n 8 8 7 8 6干预第0周5.30±0.55 16.70±3.561）18.70±2.971）14.93±3.871）18.03±4.611）干预第4周4.86±0.60 18.29±4.24 16.47±2.14 13.24±1.773）16.47±3.29干预第8周4.931±0.44 18.74±3.61 15.13±1.982）11.28±1.843）14.22±2.792）

2.2 干预8周后各组Scr和BUN比较 见表2。

表2 干预8周后各组Scr和BUN比较（）

表2 干预8周后各组Scr和BUN比较（）

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01。

组别正常组模型组石斛合剂低剂量组石斛合剂高剂量组六味地黄丸组n 8 8 7 8 6 Scr／（μmol／L-1）83.53±10.46 216.80±31.661）135.40±10.382）104.10±7.182）118.40±11.162）BUN／（mmol／L）5.34±0.64 13.51±3.661）8.72±1.192）6.63±0.582）6.58±0.942）

2.3 各组肾脏病理变化 由图1可见：HE染色后，光镜下可见正常组肾组织结构清晰，肾小球大小、形态及肾小球囊腔间隙均正常，系膜基质正常；模型组肾小球系膜基质增多，系膜区增宽，部分毛细血管腔狭窄，大量红细胞淤积，肾小管细胞体积增大，管腔狭窄；石斛合剂组较模型组有明显改善。

2.4 各组肾脏AQP2、AQP3表达变化 由图2和图3可知：模型组肾脏AQP2、AQP3的蛋白表达较正常组显著升高，石斛合剂高剂量组肾脏AQP2、AQP3蛋白表达较模型组有明显降低。说明糖尿病肾病小鼠体内存在水代谢紊乱，肾脏AQP2、AQP3表达异常增多，石斛合剂可能通过调节AQP2、AQP3的表达，调节体内水代谢平衡，从而起到防治早期糖尿病肾病的作用。

图1 各组肾脏病理变化（×400）

3 讨 论

3.1 糖尿病肾病是糖尿病发展到后期阶段肾脏功能衰竭导致的一系列病理症状，早期糖尿病肾病的中医辨证以气阴两虚为主，并可挟水湿、湿热、气滞、瘀血等［2］。施红教授经过长期临床实践，根据糖尿病的病机特点，创立了滋阴清热、益气活血通络、补益脾肾的石斛合剂方［3］。前期研究表明：石斛合剂能减少2型糖尿病模型动物胰岛细胞凋亡，促进胰岛素分泌，降低血糖血脂，改善肾功能，减轻2型糖尿病患者胰岛素抵抗作用［4-5］。

3.2 db／db小鼠是美国 Jackson实验室从C57BL／6J小鼠中筛选的瘦素受体基因缺陷的突变系，具有自发形成2型糖尿病的特性，其发病过程与人类2型糖尿病非常相似。该小鼠出生约1个月后逐渐出现肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等糖尿病症状，至出生后约2个月，开始出现糖尿病肾病症状，是研究2型糖尿病肾病理想的动物模型［6］。

3.3 石斛合剂对db／db小鼠肾功能的影响 Scr与BUN反映肾小球的滤过功能，当肾小球功能受损达50%以上时，血清肌酐与尿素氮出现升高。本次实验观察发现：19～20周 db／db小鼠血清尿素氮与肌酐明显升高，表明肾功能明显损伤；石斛合剂的干预，能够有效降低db／db小鼠血清尿素氮与肌酐，具有防治糖尿病肾病的功效。

图2 各组肾脏AQP2、AQP3表达（×100）

图3 各组肾脏AQP2、AQP3表达

3.4 石斛合剂对db／db小鼠肾脏水通道蛋白的影响 AQP2主要作用是维持机体水平衡，参与尿液浓缩和渗透压调节［7］。糖尿病患者多尿和水肿现象与水通道蛋白的作用密切相关，已有实验证明在糖尿病动物模型中AQP2的表达显著上调［8］，与本实验显示结果一致。AQP3除调节肾脏集合管主细胞水分重吸收及尿液浓缩外，还介导机体甘油、尿素等小分子物质的代谢，对终尿量形成起重要作用。当其表达产生异常时会导致尿液浓缩障碍，产生多饮、多尿现象。但糖尿病对AQP3表达的影响目前尚存在争论，有研究发现在STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏内髓中，AQP3的表达明显上调，而在STZ诱导的糖尿病小鼠的研究中发现 AQP3的表达下调［9-10］，而本实验中AQP3的蛋白表达也是上调的。

本实验结果可知：db／db小鼠呈现高血糖、肾功能障碍，说明早期糖尿病肾病小鼠模型已经建立；模型组AQP2、AQP3的蛋白表达增多，石斛合剂可下调AQP2、AQP3的异常高表达，最终达到改善小鼠血糖和肾功能的作用，表明石斛合剂防治早期糖尿病肾病的作用可能与调节水代谢相关。

由于糖尿病肾病的发生除了与水代谢相关外，还和高胰岛素血症、高脂血症、脂毒性、氧化应激、肾血流动力学改变等多因素密切相关，故中药石斛合剂改善肾功能所涉及的分子药理机制还有待进一步深入研究。