红肉火龙果果酒酿造中菌群和主营养成分分析

李永波

（黔南民族师范学院， 贵州 都匀 558000）

火龙果（Pitaya）别称红龙果、玉龙果、仙蜜桃，由于外表皮肉质鳞片化与蛟龙外鳞相似而得名，是仙人掌科三角柱属（量天尺属）的果实，主要品种分为红皮红肉，红皮白肉，黄皮白肉3种。[1]在泰国、越南等分布较广，在我国主要分布在台湾、广西、云南、福建、贵州等地。[2]红龙果是一种高营养、低热量的热带水果。[2]英国医生Nidduos写道，“火龙果属于高纤维素、低脂肪、低糖类的‘一高,两低’保健食品。[3]”火龙果果肉营养丰富，疗效独特，具有较高的治疗价值，对降血压、降血脂、解毒、养肺、养颜、改善视力等功效，对糖尿病和便秘也都有效，[4]并且红肉火龙果还含一般水果所没有的植物性白蛋白、花青素和水溶性维生素等。其中白蛋白具有解重金属中毒的作用，[5]花青素具有抗氧化的效用，可以有效防止血管硬化，可以对抗自由基，抵抗衰老。[2]根据科学分析，新鲜火龙果肉每100g主要成分包含水分80-85g，总糖9-13g，总酸 0.3-0.5g，灰分 0.34g，粗脂肪 0.17g，粗纤维1.21g。[6]火龙果果实拥有独特的外形，含有丰富的维生素C、B族维生素，膳食纤维，植物蛋白及铁、磷、镁等金属元素,开展红肉火龙果保健果酒加工技术研究可以为火龙果果酒产品的开发探索经验，为生产企业加工酿造火龙果果酒产品提供科学依据，探索火龙果深加工，带动地方经济的发展,提高红肉火龙果产品的附加值，在本次试验用的红肉火龙果产自贵州罗甸县。

1 材料与方法

1.1 材料与药品

红肉火龙果（红皮红肉）贵州省都匀市罗甸县；帝伯仕果酒专用酵母（红）由烟台帝伯仕酵母有限公司生产；马铃薯、白砂糖超市购买；葡萄糖（济宁宏明化学试剂有限公司）；琼脂（常州通城化工有限公司）；无水乙醇（南京化学试剂股份有限公司）；蒽酮试剂；茚三酮；甘氨酸；NaOH；醋酸；酚酞(化学药品为分析纯)

1.2 实验仪器与设备

LT502E型电子天平 常熟市天量仪器有限公司；

TCL16M型台式高速冷冻离心机 长沙迈佳森仪器设备有限公司；

YXQ-LS-100G型高压蒸汽灭菌锅 上海道基科学仪器有限公司；

IQS-1807型电陶炉 佛山市顺德区艾玛诗电器有限公司；

GZX-9140MBE型电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

HS-1300-U型洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；

ZHWY-211B型恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制造有限公司；

ZXDP-A2080型十段编程电热恒温培养箱上海智诚分析仪器制造有限公司；

精密酒精计 翼州市耀华器械仪表厂；

UV-721C型紫外-可见分光光度计 上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 火龙果果酒酿造工艺流程

将新鲜成熟的红肉火龙果消毒后无菌操作去皮，装罐。处理组放入用红肉红龙果液体培养基培养的帝伯仕果酒专用酵母（红），对照组自然发酵，置于25℃的恒温箱中进行发酵。卫生指标：细菌总数≤50cfu/mL；大肠菌数≤3MPN/100ml[7]。

1.3.2 发酵果酒的取样方法

在果酒发酵的第五天，从有明显的酒味，发酵正常的组开始取样，取样间隔时间为24小时，每次取样5ml，分别为上、中、下层液面各取一管。平板培养培养样液。酵母计数按照GB4789.15马铃薯-葡萄糖琼脂计数法测定,酵母细胞形态以吕氏碱性美蓝染液染色镜检为准。

用平板涂布计数时，可以先用肉眼直接观察并记录较大的菌落，菌落较小的情况下借助放大镜辅助观察，记录下最终的酵母菌数与其相应的稀释倍数，以菌落的形成单位（cfu）来表示，选取菌落数在10cfu-150cfu之间的平板计菌落数取其平均值[8]。

1.3.3 养分测定

1.3.3.1 茚三酮比色法测定游离氨基酸[9]

标准曲线的制作:1.分别取0.3mmol/L的标准甘氨酸溶液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。各加入1mLpH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，测定OD440nm）。以OD570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。利用标准氨基酸茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。而氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，通过测定570nm处的光密度，从而测定氨基酸的含量。2.氨基酸样品的测定:取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL60%乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，计算样品中氨基酸含量。

1.3.3.2 总糖的测定：采用蒽酮硫酸比色法[10]

1.3.3.3 总酸的测定：采用标准碱液滴定法

吸取待测红肉火龙果果酒2mL和水50mL置于250mL三角瓶中，加入2滴酚酞指示液，摇匀后，接着用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至终点，并保持30s内不变色，最后记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（V1）。同时做一组空白对照。

1.3.3.4 酒精计来测定酒精度[10]

在标准的温度下（20度）将酒精计垂直放入红肉火龙果待测液中，等其稳定之后，读取酒精计上的上面和液面平齐的读数就为所测酒精含量。

1.3.3.5 感官评价

紫外-可见分光光度计室温测定离心发酵液样液的光吸收波长，对其色泽进行判断并记录。

2 结果与分析

2.1 火龙果酒自然发酵与酵母发酵过程中酒精度的变化

在火龙果果汁中加入8%酵母培养液（V/V），果汁糖度调节到14%（M/V），25℃恒温发酵，测量发酵10天的酒精度结果见下图1:

图1 不同发酵方法酒精度的变化Figure1 changes in alcohol accuracy in different fermentative methods

由图1可知，在火龙果酒精发酵的过程中，随着发酵的进行，处理组发酵液样品的酒精度在不断升高，在发酵的前4天酒精含量增加得较快，变化也比较明显；自然接种发酵相对平缓，没有处理组发酵快。从第7天开始，两条线都逐渐趋于平缓，酒精度维持在8.5%-9%左右，说明发酵果汁中的糖分基本耗尽，酒精度的变化较小，生醇发酵趋于停止。

2.2 两种发酵过程中的酵母总数变化

运用自然发酵与酵母发酵两组实验对比，在25℃恒温发酵条件下，让红肉火龙果果汁进行酒精发酵，发酵第5天开始进行定时取样、培养，测定酵母菌在发酵过程中的总数变化，通过对数据的处理、筛选，分别对第5,10,15,20，25,30,35天的酵母总数进行了分析，结果见图2：

图2 发酵后熟过程菌群的变化Figure2 changes of fermentation ripenling bacteria

由图2可以看出，不管是酵母发酵还是自然发酵都是在第10-15天，酵母数量多，酵母的活力较高；从发酵第20天开始有在减少的趋势，第25-35天酵母总数的变化不大，发酵逐渐趋于稳定。

2.3 自然发酵与酵母发酵两种火龙果酒的感官评定

果酒发酵结束后，在室温条件下，选用误差为（±1nm）的紫外-可见分光光度计测量得两种发酵果酒样品色素的光吸收波长都在400-700nm之间，同时在535nm处有一个单一的吸收峰出现，无其他杂峰的干扰，光吸收波长以峰值记录，色泽上主要表现为棕红，实验的记录如下表1：

表1 光吸收与感官评定Table1 linght absorption and sensory evaluation

2.4 游离氨基酸含量随发酵时间的变化

不论自然发酵或酵母发酵，游离氨基酸有一个先下降后上升的趋势，第1至4天氨基酸的含量快速下降，至第4、5天基本检测不出，推测发酵前期酵母的繁殖需要一定量的氨基酸，后期随着分解代谢的旺盛，游离氨基酸含量有所回升，结果见图3。

图3 游离氨基酸含量随发酵时间的变化

2.5 总糖含量随发酵时间的变化

酵母发酵和自然发酵条件下，总糖含量的变化趋势相似。在其他条件不变下，随着发酵时间的变化，还原糖的下降速度很快，可能是酵母菌生理代谢旺盛，因此糖的消耗加大。[7]总趋势是总糖含量快速下降，而在第4d时糖量的增加，推测由于多糖分解代谢所致。如图4所示。

图4 总糖含量随发酵时间的变化

2.6 总酸含量随发酵时间的变化

红肉火龙果在固定温度25℃,含糖量调到15%的条件下通过自然发酵和酵母发酵两种不同的发酵方式发酵，在发酵120h后可间隔24小时进行取样，这时有明显的发酵果酒香味，所得的总酸数据和时间得出下表，如图5所示。

图5 总酸含量随发酵时间的变化

从图5中可知，在其他条件不变时，自然发酵和酵母发酵下，随着发酵时间的变化，总酸含量也在随之增加，其中从1d到4d变化最为明显，且自然发酵和酵母发酵两种发酵条件下总酸含量变化趋势相似。

2.7 酒精度随发酵时间的变化

红肉火龙果在固定温度25℃,含糖量调到15%的条件下通过自然发酵和酵母发酵两种不同的发酵方式发酵，在发酵120h后可间隔24小时进行取样，这时有明显的发酵果酒香味，所得的酒精度数据和时间得出下表，如图6所示。

图6 酒精度含量随发酵时间的变化

由图6可知，在其他条件不变的情况时，自然发酵和酵母发酵不同的发酵条件下，随着发酵时间的变化，酒精度含量不断增高，发酵时间在3d到6d时，酒精度含量变化最为明显，到7d时，酒精度含量趋于稳定，且酵母发酵的酒精度含量高于自然发酵的酒精度含量。

2.8 酵母菌种的镜检结果

酒精发酵主要产物是乙醇，在2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）实验中，根据TTC显色剂与酒精的显色反应对酵母产物进行显色处理，TTC显色剂遇酒精会显示红色，在酒精含量较高的培养基中会显现为深红色，酒精含量偏低的培养基中为浅红色。由此，可以选择深红色的酵母菌落来进行培养、纯化。用TTC培养基培养筛选得到的酵母菌发酵能力较强、生长力旺盛、同时还有较好的同步性，在接种后能迅速的进入主发酵期，有利于发酵作用和提高产品的产量及口感。[9]纯化过后得到的20株酵母菌都同时具有酵母菌典型菌落特征，将菌落划线接种在PDA琼脂斜面的培养基上。根据不同酵母菌落形态的特征、颜色、形态以及典型气味可分为[10]3大类，记录如下表2：

表2 镜检酵母细胞形态Table 2 microscopic examination of yeast cell morphology

3 结论与讨论

3.1 本试验以新鲜火龙果果实为原材料,经过破碎榨汁,进行酒精发酵结果表明，自然接种发酵与酵母接种发酵，在温度为25℃的条件下，从发酵动态的观察、酒精度及酵母总数的测定等方面的分析得出：自然接种发酵：果酒呈浅棕红色，果香四溢，有明显的火龙果香味鲜明透亮的酒体；酵母接种发酵：火龙果酒色泽棕红，酒香与果香交织，酒体晶莹透亮。自然接种发酵在前期的主发酵过程中会比酵母菌接种发酵慢，但两种发酵方式在最终的酒精度上相差不大。在果酒发酵的后熟阶段，酵母菌总数也没有太大的差异，后期自然发酵甚至比酵母发酵的更多，但差异不显著。

3.2 本试验粗测的红肉火龙果果酒成品酒精度为9%，总糖含量为20g/L，氨基酸含量为2g/L，总酸含量为15.6g/L。酵母发酵果酒中的氨基酸、总糖、总酸与自然发酵差别很小，只有酵母发酵的酒精度显著高于自然发酵。通过控制好发酵条件，就可以获得醇馥浓郁、风味协调的优质火龙果果酒。