艾灸、电针足三里对腓总神经横断术后大鼠胃黏膜损伤修复的影响

宋家薇,陈果,方倩,范萍,曽富坤,蒋全睿,田楚宁,江承,李铁浪



艾灸、电针足三里对腓总神经横断术后大鼠胃黏膜损伤修复的影响

宋家薇,陈果,方倩,范萍,曽富坤,蒋全睿,田楚宁,江承,李铁浪

(湖南中医药大学,长沙 410208)

探讨艾灸、电针启动相关内源性保护信息对胃黏膜的保护效应以及与腓总神经通路的关系。将72只SD大鼠随机分为正常组(A组)、模型组(B组)、模型艾灸组(C组)、手术模型艾灸组(D组)、模型电针组(E组)和手术模型电针组(F组),每组12只。除正常组外,其余各组均用无水乙醇、阿司匹林灌胃制备胃黏膜损伤模型,其中D组和F组在行腓总神经切断术后进行造模。C组和D组采用艾灸双侧足三里穴治疗,E组和F组采用电针双侧足三里穴治疗。治疗3 d后,采用苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠胃黏膜形态学变化,计算胃黏膜溃疡指数(UI),并采用ELISA法检测各组大鼠血清与胃黏膜组织中一氧化氮(NO)、白细胞介素-1b(IL-1b)的含量。B组、C组、D组、E组和F组UI、血清NO含量及胃黏膜组织中NO、IL-1b含量与A组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。B组、D组、E组和F组血清IL-1b含量与A组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。B组和D组UI、血清NO含量及胃黏膜组织中NO、IL-1b含量与C组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。B组和F组UI、血清NO含量及胃黏膜组织中NO、IL-1b含量与E组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。艾灸和电针足三里穴均可通过腓总神经途径传递信息,促使NO、IL-1b释放,从而有效促进胃黏膜修复,且两种方法治疗效果相近。

针灸疗法;电针;温和灸;胃黏膜损伤;穴,足三里;一氧化氮;白细胞介素-1b;腓总神经横断术;大鼠

胃黏膜损伤(gastric mucosal lesion, GML)是指由于理化因素、细菌或其毒素刺激等因素所引起的胃肠黏膜炎症、糜烂和出血的统称,表现为黏膜充血、水肿、糜烂、坏死、脱落及浅表溃疡形成。GML是全球性多发病,发病率占总人口的10%～20%[1-3]。目前西医治疗以对症治疗为主,但价格较昂贵,且不良反应明显;而中医治疗则具有“简、便、廉、效”的优势,历代许多医者使用针灸防治GML,也从不同角度探讨了针灸防治胃病的疗效。大量研究表明,针灸干预对胃黏膜具有一定的保护作用,且其保护作用与胃黏膜保护因子相关[4-5]。本课题组前期研究证实,艾灸足三里可通过腓总神经通路促进胃肠效应细胞再生,而切断腓总神经及坐骨神经后效应消失[6-8]。本实验研究旨在进一步探讨艾灸及电针足三里穴对GML修复中腓总神经途径信息传导作用的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取健康清洁级SD大鼠72只,3～4月龄,体重为200～240 g,雌雄各半,购于湖南中医药大学实验动物中心[合格证号SYXK(湘)2013-0005]。研究过程中对动物的处置方法符合国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规定。给予所有大鼠充足的标准饲料与饮水,饲养温度在20℃～25℃,相对湿度在65%～70%,光线采用昼夜12 h变化。采用查随机数字表将72只SD大鼠随机分为正常组(A组)、模型组(B组)、模型艾灸组(C组)、手术模型艾灸组(D组)、模型电针组(E组)和手术模型电针组(F组),每组12只。

1.2 主要试剂与仪器

李时珍微烟蕲艾条(4 mm×120 mm,蕲春时珍本草科技有限公司);阿司匹林泡腾片(阿斯利康制药有限公司);生理盐水(长沙维尔试剂公司);注射用青霉素(华北制药股份有限公司);水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司);TGL-16台式冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司);Tris(Sigma-aldrich);PW-812全自动酶标洗板机、MB-530酶标仪(深圳汇松科技有限公司);THZ-C恒温振荡器(太仓市强乐实验设备有限公司);E-201-C精密PH计(上海雷磁);TS-92摇床(其林贝尔仪器制造有限公司);DY89-1电动玻璃匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司);自制艾灸架;无菌针灸针(0.30 mm×25 mm,苏州医疗用品厂有限公司);G6805-Ⅱ型电针仪(青岛鑫升实业有限公司)。

1.3 造模方法

1.3.1 腓总神经横断造模

①术前禁食24 h,称重;②大鼠大腿背侧剪毛备皮,腹腔麻醉(10%水合氯醛,0.35 mL/100 g),碘伏常规消毒;③纵行切开大腿背侧皮肤,钝性分离股二头肌,用玻璃分针分离腓总神经,再用眼科剪剪断,术后剖面撒少量青霉素粉,逐层缝合切口;④术后动物分笼喂养,每只动物肌肉注射青霉素钠16万U/d,连续3 d;⑤观察3 d后进行胃溃疡造模。

1.3.2 胃溃疡造模

目前大鼠胃溃疡实验造模方法常用的有水浸拘束法胃溃疡造模、幽门结扎胃溃疡造模、幽门螺杆菌感染胃溃疡造模和无水乙醇直接灌胃造模等,而根据本实验需求,造模先用无水乙醇灌胃造成急性胃黏膜损伤,再应用非甾体抗炎药续灌使溃疡加重,愈合延缓。本法具有简单、经济、易复制的特点,且更符合本实验要求与目的[9-11]。造模方法参考相关文献[12]进行改良(此模型已在预实验中证实可行性),具体步骤为①所有大鼠灌胃前均禁食24 h,24 h后行无水乙醇灌胃(A组予以生理盐水灌胃),灌胃按照每只0.6 mL/100 g无水乙醇剂量灌入相应剂量,按一般的灌胃方法将无水乙醇灌入胃内1次;②将阿司匹林泡腾片(Asp)每2 000 mg溶于100 mL生理盐水配置成阿司匹林混悬液,无水乙醇灌胃完成1 h后再予阿司匹林混悬液连续灌胃,按Asp 200 mg/Kg灌胃(A组采用生理盐水灌胃,下同),大鼠每次灌胃给药前禁食不禁水12 h,每日1次,连续4 d;③第5日予2%戊巴比妥钠50 mg/Kg腹腔注射麻醉后将大鼠处死,行剖检取胃,观察采集标本,观察及记录胃窦部黏膜的形态变化情况,以出现黏膜水肿、糜烂、出血、溃疡等病理改变为造模成功评价标准。

1.4 分组处理

A组予生理盐水对照灌胃,仅做捆绑处理,每日2次,每次30 min,连续3 d。

B组建立胃溃疡模型后行捆绑处理。

C组建立胃溃疡模型后观察3 d,然后予以温和灸治疗。取双侧足三里穴,穴位定位参照《实验针灸学》,即足三里位于膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处[13]。将大鼠捆缚于鼠板后,穴位局部备毛,将隔热贴剪3 mm孔,贴于穴位上,艾条固定在自制艾灸支架上,距离穴位约5 mm处,艾灸温度控制在42℃左右,治疗30 min。每日2次,连续治疗3 d。大鼠治疗后放回笼正常饲养。

D组行腓总神经横断术造模后,继续建立胃溃疡模型。造模成功后予以温和灸治疗。取穴及操作方法同C组。

E组建立胃溃疡模型后观察3 d,然后予以电针治疗。取穴同C组。将大鼠取俯卧位固定于鼠板上,采用0.30 mm×25 mm毫针直刺约3 mm,行小幅度提插捻转手法(平补平再)1 min。然后在足三里近心端旁开2 mm处(辅助针刺点)再剌1针,针刺深度约为3 mm,不做任何行针手法,其目的是与同侧足三里穴构成1对导联。分别将足三里与同侧辅助针剌点作为1组连接电针仪,注意两电极夹金属面不能相互靠在一起,然后打开电针仪电源开关,选择经针模式,用疏密波,频率为2/100 Hz,强度以动物双下肢轻微颤动为度,留针30 min。每日2次,连续治疗3 d。

F组行腓总神经横断术造模后,继续建立胃溃疡模型。造模成功后予以电针治疗。取穴及操作方法同E组。

1.5 观察指标

1.5.1 胃黏膜损伤指标

大鼠处死后取胃组织,结扎幽门和贲门部,于两结扎线的两端将食道及十二指肠切断,取全胃。予以冰生理盐水冲洗胃内容物,用直尺和放大镜按GUTH法[14]在冰块上计算溃疡指数(UI)。损伤≤l mm(包括糜烂点)为1分;损伤＞1 mm且≤2 mm为2分;损伤＞2 mm且≤3 mm为3分;损伤＞3 mm且≤4 mm为4分;损伤＞4 mm为5分;损伤宽度＞2 mm者指数加倍。每只大鼠的UI＝胃黏膜各处糜烂计分值的和。

1.5.2 一氧化氮(NO)和白细胞介素-1b(IL-1b)含量

胃黏膜组织匀浆中IL-1b、NO的检测按照长沙维尔公司大鼠血清IL-1b、NO ELISA法试剂盒的要求进行;血清中IL-1b、NO的检测采用ELISA法检测,按照长沙维尔公司试剂盒的要求进行。

1.6 统计学方法

所有数据采用SPSS23.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布,以均数±标准差表示。多组计量资料不满足正态性时,选择-检验;满足正态性时,采用单因素方差分析(),多重比较选用法或法。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胃黏膜形态学比较

各组大鼠治疗后均对胃黏膜进行苏木精-伊红染色。A组大鼠胃黏膜毛细血管丰富,上皮结构完整,细胞排列整齐有序;B组大鼠胃黏膜全层结构破坏,胃腺细胞大量坏死,细胞排列无序;C组大鼠胃黏膜表面有部分脱落,细胞内充血情况明显改善;D组大鼠胃黏膜表面破损较严重,有胃腺细胞坏死,细胞排列无序,但细胞内充血情况有改善;E组大鼠胃黏膜表面有破损,细胞内充血情况明显改善,但仍可见少量充血;F组大鼠胃黏膜表面破损,细胞排列杂乱无序。详见图1。

图1 各组大鼠胃黏膜形态学比较(×400)

2.2 各组大鼠UI比较

由表1可见,B组、C组、D组、E组和F组UI与A组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。B组和D组UI与C组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。B组和F组UI与E组比较,差异均具有统计学意义 (＜0.01)。提示艾灸、电针均能有效促进GML的修复,且修复作用是基于腓总神经通路完整的条件下,两种刺激方法修复效果相似。

2.3 各组血清及胃黏膜组织中NO、IL-1b含量比较

由表2可见,B组、C组、D组、E组和F组血清NO及胃黏膜组织中NO、IL-1b含量与A组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。B组、D组、E组和F组血清IL-1b含量与A组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。B组和D组血清NO及胃黏膜组织中NO、IL-1b含量与C组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。B组和F组血清NO及胃黏膜组织中NO、IL-1b含量与E组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。提示艾灸、电针能调节血清与胃黏膜组织中NO、IL-1b含量,从而有效促进GML的修复,且该修复作用是基于腓总神经通路完整的条件下。

表1 各组大鼠UI比较 (±s,分)

注:与A组比较1)＜0.01;与C组比较2)＜0.01;与E组比较3)＜0.05

表2 各组血清及胃黏膜组织中NO、IL-1b含量比较 (±s,pg/mL)

注:与A组比较1)＜0.01,2)＜0.05;与C组比较3)＜0.01;与E组比较4)＜0.01

3 讨论

3.1 针灸足三里对GML修复的疗效

参与黏膜防御和黏膜损伤后的修复是一个比较复杂和受多种因素影响的过程,是一个相互联系、相互作用的复杂网络体系。GML及修复是一种动态过程,当外来或内在的刺激增强时,黏膜保护能力也随之增大,其调节机制主要是通过神经、体液等途径完成,并受各种损伤和抗损伤因素的影响。乙醇及应激等条件下所致的GML,在损伤部位及其周围组织细胞生成并释放大量细胞因子,某些细胞因子间还形成相互制约、相互作用的细胞因子网络,对细胞的增殖和凋亡发挥调节作用,对溃疡的发生、发展和修复过程产生广泛影响[15]。

目前关于艾灸及电针对腓总神经横断术后大鼠GML修复作用的实验研究较多,而关于艾灸和电针之间对于腓总神经横断术后大鼠GML修复作用机制的差异性研究则鲜有报道[16-17]。经络系统核心理论是“经脉-脏腑相关”,足阳明经属胃络脾,是针灸治疗胃腑疾病的重要纽带。足三里既是胃的下合穴,又是胃经的合穴,根据“经络-脏腑相关”理论,足三里在针灸促进胃黏膜修复中发挥了重要的信息传递作用[18]。现代医学认为,足三里穴浅层有腓肠外侧皮神经分布,深层则有腓深神经肌支分布,足三里的刺激信息可由腓肠外侧皮神经和腓深神经、腓总神经、坐骨神经至脊髓向中枢传入,从而调节相关因子,修复胃黏膜[19]。本实验结果显示,B组、C组、D组、E组和F组均出现黏膜水肿、糜烂、出血、溃疡等病理改变,且UI均显著大于A组(＜0.01),提示本实验造模成功,可以真实反映GML变化;B组和D组UI显著高于C组(＜0.05),B组、F组UI显著高于E组(＜0.05),而D组、F组与B组UI比较差异均无统计学意义(＞0.05),表明艾灸、电针可明显降低GML大鼠的UI,而腓总神经横断术对艾灸、电针刺激降低UI存在明显干扰,表明电针、艾灸足三里均可明显改善GML大鼠胃黏膜组织形态,降低UI,两者疗效相近且修复作用基于腓总神经通路。

3.2 内源性因子NO、IL-1b与GML修复

本课题组前期研究已证实,艾灸预处理足三里穴对大鼠GML修复的可能是通过腓总神经调控内源性因子表达有关[19],而本实验主要是观察艾灸、电针足三里对大鼠GML修复过程中内源性因子NO、IL-1b影响。NO是一类具有多生物效应的小分子化合物,存在对机体的“双刃”作用,既具有内源性修复功能,又具有强大的炎性介质作用。生理状态下,胃黏膜血管内皮细胞和神经细胞可产生少量NO,能够调节胃黏膜微循环与黏液的分泌,从而保护胃黏膜;而在炎症等病理状态下,持续产生过量的NO,能通过引起正常基因发生突变且与生成毒性更大的羟自由基、过氧硝基阴离子介导,导致细胞膜脂质过氧化损伤和细胞毒性[20]。炎症细胞能够分泌和释放的大量细胞因子,如白介素、肿瘤坏死因子、g-干扰素等,能激活一氧化氮合酶(iNOS)表达增强[21]。其中损伤作用于胃黏膜导致局部微循环变化,诱导炎性细胞因子与肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的产生,进而诱导诱导型iNOS的大量产生,iNOS通过激活凋亡关键蛋白酶的级联反应,诱导大量细胞凋亡。本实验结果显示,造模后大鼠血清NO与组织NO水平下降,而电针、艾灸均可调节血清NO与组织NO水平,促使其上升从而发挥修复作用,且其修复作用部分受到腓总神经调节的影响。

IL-1b是近年来研究较多的细胞因子,能够促进内皮细胞增殖和细胞外基质沉积。有研究发现,IL-1b对正常成纤维细胞的刺激增殖并非直接的作用,而是先通过诱导产血小板衍生生长因子(PDGF)等,而后协同PDGF等刺激细胞生长[22]。在许多组织中,IL-1b能诱导NO产生,从而抑制细胞凋亡,同时NO合成抑制剂能够逆转IL-1b,具有刺激NO产生与抑制细胞凋亡作用,说明在IL-1b抑制细胞凋亡作用中,NO起到中介作用。而在细胞进入生长稳定期时,IL-1b又能诱导细胞凋亡。当胃黏膜受到损伤时,NO作为一种重要的内源性修复因子,可起到扩张黏膜血管、增加血流量作用[23];IL-1b作为一种损伤因子,可促进炎症因子表达,并起到协同作用,促进中性粒细胞浸润[24]。本实验结果显示,GML可使血清及组织IL-1b水平上升,而电针、艾灸均可调节血清及组织IL-1b的释放,且其修复作用部分受到腓总神经调节的影响。

3.3 小结

综上所述,本实验结果显示,①艾灸、电针可明显降低GML大鼠的UI,腓总神经横断术能明显干扰艾灸、电针降低UI;②艾灸、电针调节血清与组织中IL-1b、NO含量从而保护胃黏膜的作用部分受到神经调节的影响,证明腓总神经通路是艾灸、电针对胃黏膜保护效应信号神经通路的一部分,起到了传导信息作用;③艾灸、电针两种方法刺激足三里对胃黏膜保护效应作用效果相似。因此,本实验认为艾灸、电针刺激足三里穴均可通过腓总神经途径传递信息,促使调节胃黏膜保护因NO、IL-1b的释放,从而有效促进胃黏膜修复,且两种刺激方法治疗效果相似。

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Effect of Moxibustion and Electroacupuncture at Zusanli (ST36) in Rats on Repair of Injured Gastric Mucosa After Common Peroneal Nerve Transection

,,-,-,-,,-.

,410208,

To investigate the protective effect of moxibustion and electroacupuncture in initiating the relative endogenous protection information on gastric mucosa, and its relationship with the pathway of common peroneal nerve.Seventy-two Sprague-Dawley (SD) rats were randomized intoa normal group (group A), a model group (group B), a moxibustion model group (group C), a moxibustion plus surgery model group (group D), an electroacupuncturemodel group (group E) and a electroacupuncture plus surgery model group (group F), with 12 rats in each group. Except for group A, rats in the other groups were treated with dehydrated ethanol and aspirin to prepare gastric mucosal lesion model. The rats in group D and group F were subjected to preparing the gastric mucosal damage model after the common peroneal nerve transection. Group C and group Dwere intervened by moxibustion at Zusanli (ST36), while Group E and group Fwere intervened by electroacupuncture at the same acupoints. After 3-day treatment, morphological changes in gastric mucosa of rats in each group were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining, ulcer index (UI) was calculated, and nitric oxide (NO) and interleukin-1b(IL-1b) contents in serum and gastric mucosa tissue were examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The UI, NO content in serum, and NO and IL-1bcontents in gastric mucosa tissue in group B, group C, group D, group E and group F were significantly different from those in group A (＜0.01,＜0.05). The IL-1bcontent in serum in group B, group D, group E and group F was significantly different from that in group A (＜0.01,＜0.05). The UI, NO content in serum, and NO and IL-1bcontents in gastric mucosa tissue in group B and group D were significantly different from those in group C (＜0.01). The UI, NO content in serum, and NO and IL-1bcontents in gastric mucosa tissue in group B and group F were significantly different from those of group E (＜0.01).Both moxibustion and electroacupuncture at Zusanli (ST36) can transmit information through the pathway of common peroneal nerve, so as to promote the release of NO and IL-1b, which can effectively promote the recovery ofgastric mucosa. The treatment efficacy of these two methods is similar.

Acupuncture-moxibustion therapy; Electroacupuncture;Mild moxibustion; Gastric mucosal lesion; Acupoint, Zusanli (ST36); Nitric oxide; Interleukin-1b; Common peroneal nerve transection; Rats

1005-0957(2019)13-0006-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.13.0006

2018-09-03

国家重点基础研究发展计划(2015CB554502);国家自然科学基金项目(81303050);湖南省研究生科研创新项目(CX2016B369);湖南省优秀博士论文资助项目(2014-2016)

宋家薇(1994—),女,2016级硕士生,Email:407821617@qq.com

李铁浪(1969—),男,教授,Email:litielang810@163.com