系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞miRNA-199a-3p表达及调控机制

施善芬，黎良达，潘翠萍，单爱琴，何永平

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种常见的慢性自身免疫性疾病[1]，SLE患者免疫细胞自噬功能出现异常，导致患者自身抗体对自身抗原产生高度特异性反应[2-3]，从而导致全身多器官脏器受累，严重者出现器官衰竭而死亡。SLE的确切病因尚未完全阐明，但相关研究指出，SLE具有明显家族聚集性[4]，说明SLE发病与基因变异及异常表达有关联。miRNA在转录后水平对靶基因进行表达调控[5-6]，有研究[7]指出miRNA-451a通过靶向IFN调节因子8而促进SLE发生。miRNA-199a-3p广泛参与多种肿瘤细胞的增殖和凋亡等过程[8]，其能够调节mTOR等多条信号通路[9]，因此miRNA-199a-3p可能成为SLE发病的关键点。本研究探究miRNA-199a-3p在SLE外周血单个核细胞的表达水平以及与疾病进展的关系，同时探究miRNA-199a-3p在SLE发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年6月至2018年1月在本院诊治的50例SLE患者，其中30例处于活动期的SLE患者作为活动期组(ASLE)，20例处于缓解期的SLE患者作为缓解期组(RSLE)，同时选取25名健康志愿者作为对照组(Control)；所有入选患者均符合美国风湿病学会制定的系统性红斑狼疮诊断标准和本研究的标准要求[10]。活动期组患者男3例、女27例；年龄20～65岁，平均(42.4±10.3)岁；病程2～11年、平均(5.5±2.1)年。缓解期组患者男2例、女18例；年龄20～65岁，平均(40.9±11.2)岁；病程2～11年、平均(5.3±2.2)年，对照组入选者男3例、女22；年龄22～63岁，平均(41.5±9.7)岁。3组入选者年龄、性别等资料比较没有显著性差异(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 入选和排除标准：入选标准：(1)所有入选SLE患者经检测明确诊断为SLE；(2)入选者均对本研究内容完全了解；(3)本研究内容得到本院伦理委员会批准；(4)所有入选者均在知情同意书中签字；(5)所有入选者资料均齐全。排除标准：(1)排除存在类风湿性关节炎、心脑血管疾病、肝肾功能衰竭、糖尿病、精神疾病等患者；(2)排除处于哺乳期或妊娠的女性患者；(3)排除近期服用对本研究存在影响的药物患者。

1.2.2 实时定量PCR:分别抽取清晨空腹状态下3组入选者静脉血5 ml,并与PBS缓冲液等比例混匀，然后加入5 ml细胞分离液后，离心收集第二层的单核细胞，再加入细胞洗剂并混匀后，离心收集沉淀的外周血单个核细胞。运用实时定量PCR检测3组入选者外周血单个核细胞miRNA-199a-3p的相对表达量。利用miRNA分离试剂盒从单核细胞中进行总miRNA提取，利用逆转录试剂盒逆转录制备cDNA。反应条件为：42 ℃反应60 min和 70 ℃反应10 min。miRNA-199a-3p相对表达量检测通过实时定量PCR(以cDNA为模板)进行，并用U6做为内参照。反应条件：(1)95 ℃条件下预变性40 sec；(2)95 ℃条件下变性5 sec；(3)60 ℃条件下反应30 sec，每个设置3个平行，共循环40次。结束后计算3组样品中miRNA-199a-3p相对表达量。miRNA-199a-3p 上游引物：5′-ACACCAGCTGGGTACAGTAGTCTGCACA-3′, 下游引物：5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC AT-3′。

1.2.3 荧光素酶报告实验：根据TargetScan靶点预测软件预测miRNA-199a-3p的结合位点。人工合成 mTOR 3′UTR基因片段，根据野生型(Wild type, WT)序列对种子序列互补序列的突变位点进行设计并引入到pMIR-reporter 中，pMIR-reporter质粒同时包含Hind Ⅲ和Spe Ⅰ两个内切酶位点。经限制性内切酶和T4 DNA 连接酶处理后的目的片段插入到荧光素酶报告质粒pMIR-REPORT中。经测序检测后将序列正确的WT荧光素酶报告质粒或者突变型(mutant type, MUT)荧光素酶报告质粒与β-半乳糖苷酶表达质粒以及miRNA-199a-3p mimics (miRNA-199a-3p mimics Sense:5′-ACAG UAGUCUGCACAUUGGUUA-3′；Antisense: 5′-ACCA AUGUGCAGACUACUG UUU-3′)或阴性对照共转染至HEK-293T 细胞中。收集转染 2 d后的HEK-293T细胞，裂解处理后利用β-半乳糖苷酶和荧光素酶检测系统检测两种酶活性，对相对荧光素酶活力进行计算。

1.2.4 RNA转染:通过Lipofectamine 2000将miRNA- 199a-3p mimics序列(miRNA-199a-3p mimics Sense:5′-ACAGUA-GUCUGCACAUUGGUU A-3′；Antisense: 5′-ACCAA-UGUGCAGACUACUG UUU-3′)转染至外周血单个核细胞，即mimics组，另将仅Lipofectamine 2000处理的外周血单个核细胞作为阴性对照组，未做任何处理的外周血单个核细胞作为空白对照组。转染1～2 d后，收集细胞进行相关蛋白检测。

1.2.5 Western blot 检测：收集3组外周血单个核细胞，在4 ℃条件下，经过RIPA蛋白裂解液裂解 30 min后，收集总蛋白，经过考马斯亮蓝法对总蛋白进行定量后。利用分离胶(8%)以及浓缩胶(5%)对30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。转模和蛋白封闭后，在4℃下孵育鼠单克隆一抗(Abcam)过夜，洗膜处理后进行羊抗鼠二抗(Abcam)孵育，然后进行显影和成像，利用Image J软件进行蛋白分析。

1.2.6 凋亡检测：收集转染mimics的单个核细胞、阴性对照组细胞和空白对照组细胞，经PBS清洗后加入结合缓冲液100 μl以及Annexin-V 2 μl，避光室温下孵育30 min后，加入碘化丙啶(PI)2 μl，进一步避光室温下孵育2 min，注入结合缓冲液400 μl，收集细胞并利用流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.7 观察指标:对入选的SLE患者进行SLE疾病活动度指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)评分，SLEDAI≥5的患者处于活动期，SLEDAI<5的患者处于缓解期。

活动期患者：因SLE疾病活动而门诊诊治或住院7 d内的患者；缓解期患者：相距第一个观察时间点后第12个月，处于疾病缓解期的患者。统计入选患者脏器受累(浆膜炎、血尿、皮疹、白细胞降低、血管炎、肾炎、脱发和光过敏)情况，并分析有与无以上脏器受累患者miRNA-199a-3p表达水平。SLE皮肤血管炎相关诊断包括皮肤红斑(面部及其他部位)，溃疡，雷诺现象，网状青斑，结节红斑，皮肤紫癜；SLE肾脏病变指标包括血尿(尿相差提示为肾小球源性)、蛋白尿、管型尿。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 3组入选者外周血单个核细胞中miRNA-199a-3p表达

图1 健康志愿者、缓解期和活动期SLE患者外周血单个核细胞miRNA-199a-3p扩增曲线Fig 1 Amplification curve of miRNA-199a-3p in peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteers, remission and acute SLE patients

qRT-PCR各组基因扩增图形均呈S形(图1)，扩增正常。健康志愿者外周血单个核细胞miRNA-199a-3p相对表达量为2.38±0.24，显著高于缓解期SLE患者(1.25±0.19)(P<0.05)；与缓解期相比，活动期SLE患者外周血单个核细胞miRNA-199a-3p相对表达量(0.34±0.07)显著降低(P<0.05)；且活动期SLE患者外周血单个核细胞的miRNA-199a-3p相对表达量显著低于调节性B细胞(Bregs)和CD4+T淋巴细胞(CD4+T)，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.2 miRNA-199a-3p表达与 SLE 疾病活动度的关系

Pearson相关分析表明，miRNA-199a-3p相对表达水平与 SLEDAI评分间呈负相关性(R=-0.704，P<0.05)(图3)。

2.3 SLE患者外周血单个核细胞miRNA-199a-3p表达与脏器受累的相关性

浆膜炎、血尿、血管炎、脱发和光过敏患者外周血单个核细胞miRNA-199a-3p表达水平与无以上临床表现患者表达相近(P>0.05)；而皮疹、白细胞降低和肾炎患者miRNA-199a-3p表达水平显著高于无以上临床表现患者(P<0.05)(表1)。

图 2 外周血单个核细胞miRNA-199a-3p的相对表达量Fig 2 Relative expression level of miRNA-199a-3p in peripheral blood mononuclear cells

图 3 miRNA-199a-3p相对表达量与SLEDAI评分间的相关性Fig 3 Correlation of miRNA-199a-3p relative expression level and SLEDAI score

2.4 miRNA-199a-3p对单个核细胞凋亡的影响

结果显示，转染 miRNA-199a-3p mimics后，单个核细胞凋亡率显著高于阴性对照组和空白对照组，差异存在显著统计学意义(P<0.05)(图4)。

2.5 miRNA-199a-3p的结合位点

Targetscan7.1生物信息学软件预测mTOR mRNA的 3′UTR存在miRNA-199a-3p结合位点，即mTORmRNA是 miRNA-199a-3p的靶点(图5A)。荧光素酶报告实验验证靶点结果显示， 与miRNA 阴性对照组(miRNA NC组)相比，miRNA-199a-3p mimics可显著抑制mTOR野生型 3′UTR的荧光素酶活性，而对突变型的 3′UTR荧光素酶活性未见显著的抑制作用(图5B)。

表1 SLE患者脏器受累与miRNA-199a-3p水平的相关性Table 1 Correlation between organ involvement and miRNA-199a-3p level in SLE patients

2.6 PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达

转染miRNA-199a-3p mimics并检测相关蛋白发现：外周血单个核细胞转染miRNA-199a-3p mimics后，mTOR、PI3K、pAKt和Bcl-2水平显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)，而bax与caspase-3表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)(图6A,B)。

3 讨论

SLE作为一种慢性自身免疫性疾病常出现免疫耐受功能紊乱、炎症因子异常活化等，导致患者出现全身多器官脏器受累[11-12]。目前，SLE发病原因尚未完全阐明，但相关研究指出，SLE发病多与基因变异及异常表达相关[13]。miRNA-199a-3p作为一种非编码RNA广泛参与细胞增殖、炎症反应、自噬、氧化应激反应等生物过程[14-15]。有研究发现miRNA-199a-3p在骨肉瘤细胞中低表达[16]，而Nan等[17]发现miRNA-199a-3p在脂肪细胞中高表达，表明miRNA-199a-3p在不同的组织中表达水平不同。万小平等[9]研究发现miRNA-199a-3p能够通过mTOR信号通路而抑制子宫内膜癌细胞的增殖和促凋亡， mTOR信号通路在免疫细胞分化、自噬、炎性细胞因子分泌、氧化应激等过程中具有重要影响[18]。而miRNA-199a-3p 在SLE患者的表达以及miRNA-199a-3p对SLE患者mTOR信号通路的调节尚未见报道。

图 4 miRNA-199a-3p对单个核细胞凋亡的影响Fig 4 Effect of miRNA-199a-3p on apoptosis of mononuclear cells

图 5 miRNA-199a-3p靶点预测及荧光素酶报告实验验证Fig 5 miRNA-199a-3p target prediction and luciferase reporter test

图 6 外周血单个核细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达情况Fig 6 Expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related proteins in peripheral blood mononuclear cells

本研究对30例活动期SLE患者、20例缓解期SLE患者以及25例健康志愿者外周血单个核细胞的miRNA-199a-3p进行RT-PCR检测，结果显示：miRNA-199a-3p表达水平在健康志愿者、缓解期患者和活动期患者中依次显著降低，说明SLE发病可能与miRNA-199a-3p表达抑制有关。SLE的病因和发病机制十分复杂，患者常出现关节炎、脱发、血尿等临床症状[19]，目前国际上应用最广的活动性判断标准为SLEDAI 评分。SLEDAI 评分能够反映患者病情，并能够帮助医务工作者判断患者病情严重程度和指导用药剂量的选择。本研究分析miRNA-199a-3p表达水平与SLE疾病活动度的相关性，发现miRNA-199a-3p表达水平与 SLEDAI 评分间存在负相关关系。提示miRNA-199a-3p表达水平能够反映SLE患者活动程度。进一步对miRNA-199a-3p表达水平与脏器受累的关系进行分析，发现皮疹、白细胞降低和肾炎SLE患者具有较高的miRNA-199a-3p表达水平。miRNA-199a-3p表达水平和 SLEDAI 评分、脏器受累间的关系为miRNA-199a-3p作为SLE病情评估指标提供了理论基础。

MiRNA通过与mRNA的3′URL区结合而降解mRNA或促进mRNA翻译，从而影响细胞增殖、分化、自噬、氧化应激反应等[20]。用Targetscan7.1生物信息学软件和荧光素酶报告实验对miRNA-199a-3p靶点进行预测和验证，发现miRNA-199a-3p的靶点为mTOR mRNA 3′UTR，其能够抑制mTOR mRNA的翻译，与Wu等[21]报道相一致。为进一步探究miRNA-199a-3p在SLE发病机制中的作用，对外周血单个核细胞进行了miRNA-199a-3p mimics转染，并检测PIAK/Akt/mTOR信号通路中相关蛋白水平。WB检测结果显示：加入miRNA-199a-3p mimics能够降低mTOR、PI3K、pAKt和Bcl-2水平同时上调Bax与caspase-3表达水平。有研究报道mTOR能够促进AtgI3磷酸化，并导致其从AtgI复合物上脱落而抑制自噬[22]。miRNA-199a-3p降低mTOR表达水平有利于AtgI和磷酸化的AtgI3结合，促进代谢重新激活进而诱导自噬的产生。miRNA-199a-3p降低mTOR表达水平也进一步导致了PI3K和Akt表达水平变化，其可能原因为：经targetscan预测发现，miRNA-199a-3p可能调节513个靶点基因，miRNA-199a-3p水平升高，可能导致某靶点蛋白异常表达，从而进一步影响PI3K和Akt表达水平。Bax与caspase-3为凋亡相关蛋白。miRNA-199a-3p提高Bax与caspase-3表达水平，从而可促进外周血单个核细胞的凋亡。本研究结果证明上调miRNA-199a-3p导致单个核细胞凋亡率明显增加，而凋亡和自噬能力提高可减少死亡细胞和细胞器的积累，从而减少自身抗原抗体的产生和炎症因子的爆发，而减缓SLE病情。

综上所述，miRNA-199a-3p对SLE病情评估及发病机制探究具有一定意义，但由于本研究样本较少、作用机制研究不深入，后续仍要扩大样本并对miRNA-199a-3p作用机制进行深入研究。