c-Myc、mTOR、HIF-1α基因启动子区域DNA甲基化与类风湿关节炎的相关性

黄海燕，邹荣鑫，李晓可，褚赞波，施善芬，应 颖，彭 勇，张 顺，陈 勇

近年来相关研究发现 Th17和Treg细胞在类风湿关节炎(rheumatoid arthribis,RA)发生和进展过程中起着至关重要的作用[1]。糖代谢与Th17/Treg细胞分化密切相关[2]。RA患者关节滑膜增厚、大量炎症细胞浸润及炎症因子释放造成关节微环境的缺氧，缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是调节体内细胞缺氧反应的核心因子[3]。有研究发现转录因子HIF-1α调控Th17的分化过程向无氧糖酵解方向发生代谢转变[4-6]。c-Myc 活化可上调与葡萄糖吸收及糖酵解相关基因的表达，且与HIF-1α 协同调节体内糖代谢[7]。mTORC1会通过影响个别信使RNA的翻译过程而影响HIF-1α的活性[8]。DNA甲基化(DNA methylation)是一种表观遗传(epigenetic)修饰，是免疫性疾病、肿瘤、高血压等多种疾病发生过程中的一个重要危险因素[9]，一般来说，DNA甲基化会抑制基因的表达[10]。

本研究探讨RA患者c-Myc、HIF-1α、mTOR基因启动子区域甲基化水平，以期深入研究RA的发病机制，为RA患者早期诊断及治疗提供新思路。

1 对象与方法

1.1 对象

2017年5月至10月就诊于宁波市第二医院符合纳入标准和排除标准的RA患者45例为RA组，其中女35例，男10例;同期来自宁波市第二医院体检中心的体检人群45例为对照组，其中女35例，男10例。RA诊断标准参照美国风湿病学会1987年RA诊断标准[11]。排除标准：(1)合并其他风湿性疾病；(2)合并其他慢性疾病；(3)明显血液学指标异常：外周血白细胞计数<4×109/L或血小板计数<100×109/L；(4)感染、肿瘤等引起的关节疼痛。在上述标准基础上并确认人群之间无血缘关系。本研究所有受试者均签署知情同意书。

记录研究对象的年龄(Age)、性别(Sex)、类风湿因子(RF)、免疫球蛋白(IgM、IgG)、C反应蛋白(CRP)、血沉(ESR)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HB)、压痛关节数(TJC)、肿胀关节数(SJC)、DAS28评分(DAS28)等。

1.2 方法

经医院医学伦理委员会批准，患者知情同意签字后抽取受试者外周静脉血2 ml至2% EDTA管中。用QIAamp DNA试剂盒(QIAGEN公司，德国)提取全基因组DNA，并置于-80 ℃冰箱保存。用DNA甲基化修饰试剂盒(Zymo公司，美国)对DNA进行亚硫酸盐修饰[12-14]。PCR引物合成由PyroMark Assay Design 2.0 (QIAGEN, 德国) 设计，由华大基因合成(引物序列见表1)。PCR反应体系(50 μl)：H2O 34.8 μl，5×buffer GC(KAPA)10 μl，dNTP(10 mmol/each)1 μl，Primer(up 50 pmol/μl)1 μl，Primer(down 50 pmol/μl)1 μl，Template 2 μl，Taq(5 U/μl)0.2 μl。反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min，共 40循环。最后用焦磷酸检测仪(PyroMark Q96 ID，QIAGEN公司，德国)进行甲基化水平检测[12-14]。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequence of gene

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 基因启动子区甲基化与临床指标的相关性

所选实验组样本的甲基化与临床指标的相关性分析结果显示，RF、IgM、IgG、CRP、ESR、ALT、AST、WBC、TJC、SJC、DAS28在HIF-1α pos1和c-Myc(pos 2、3、4、5、6)位点上均无统计学差异(P>0.05)；Age在c-Myc(pos 4、6)位点上具有统计学差异(P<0.05)，Sex在c-Myc(pos 3、4)位点上具有统计学差异(P<0.05)，HB在c-Myc(pos 2、4、6)位点上具有统计学差异(P<0.05)(表2)。

表2 DNA甲基化与临床指标的相关性Table 2 Correlation analysis of DNA methylation and clinical data

2.2 基因启动子区甲基化水平比较

RA组与健康对照组HIF-1α pos 1和c-Myc(pos 2、3、4、5、6)甲基化水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)，经过Bonferroni校正后，c-Myc(5、6)甲基化水平两组间差异仍具有统计学意义(P<0.05)。其他位点甲基化水平两组比较差异无统计学意义 (P>0.05) (表3)。

2.3 ROC曲线分析

受试者工作特征曲线(ROC曲线)显示c-Myc(pos 5、6)的甲基化水平对诊断类风湿关节炎的准确性较低[ROC曲线下面积(AUC)：0.5～ 0.7，P<0.05]。当c-Myc pos 5的甲基化率≤9.48 时，灵敏性(SE)和特异性(SP)值最大(SE为0.69，SP为0.67)(表4)。

3 讨论

RA是难治性疾病，具体病因及发病机制目前尚不清楚。有文献报道基因突变与RA发病具有相关性，如TNFα[15]、IL-1[16]、IL-10[17]等。近来有研究发现RA患者基因组存在广泛低甲基化[17]，提示DNA甲基化可能参与了RA疾病的发生及发展。本研究RA患者组与健康对照组的c-Myc(pos 5、6)甲基化水平比较差异具有统计学意义(经过Bonferroni校正)，RA组c-Myc(pos 5、6)位点处于低甲基化水平，进一步证实RA患者基因组存在低甲基化，与徐晓等[18]结果相符。

近来研究发现，促炎性Th17细胞与抗炎性Treg细胞平衡紊乱导致了RA活动性的加剧[19]，提示Th17细胞和Treg细胞在调控RA发病中有着重要作用[20-21]，糖代谢与Th17/Treg细胞分化有着非常密切的联系。本研究结果显示，c-Myc(pos5、6)位点处于低甲基化水平，笔者猜想c-Myc的低甲基化促进了基因的高表达，从而促进了糖酵解途径，进而导致Th17/Treg细胞的比例失衡，并且平衡向Th17细胞一方偏移，最终加重了RA患者的炎症反应，这与从机制上的猜想结果一致，可以解释RA的发病机制。

RA并发贫血在临床上比较常见，慢性病性贫血(anemia of chronic disease,ACD)是RA最常见的贫血原因，其发病机制尚未完全明确，有研究认为，TNF-α、IL-1、hepcidin等炎性细胞因子在各种原因引起的慢性贫血中占有重要地位[22-25]。本研究发现，HB在c-Myc(pos 2、4、6)位点上与甲基化率均呈正相关，且均具有统计学差异(P<0.05)，笔者根据实验结果从机制上推测，c-Myc低甲基化促进了c-Myc基因的高表达，从而促进了糖酵解途径，进而导致Th17/Treg细胞的比例失衡，最终加重了RA患者的炎症反应，可能也参与了ACD的发病过程。

表3 基因启动子区甲基化水平比较Table 3 Comparison of methylation levels of genes in RA and healthy controls (%)

表4 ROC曲线分析Table 4 ROC curve analysis of gene sites

ROC曲线被用来评估各个试验在疾病诊断中的能力，并且选择出最佳的诊断界限值，AUC通常是ROC曲线中一个重要评价标准[26-27]。本研究c-Myc(pos 5、6)ROC曲线分析显示：所有AUC均在0.5～0.7之间,提示将上述甲基化位点作为RA的诊断指标具有较低的准确性。

综上所述，c-Myc(pos 5、6)基因在RA中处于低甲基化水平，结合基因功能分析，c-Myc(pos 5、6)低甲基化水平可能增加RA的发病风险，c-Myc(pos 2、4、6)可能通过调控Th17/Treg平衡参与RA伴ACD的发病过程。

本研究不足之处：首先，本研究对全血细胞进行研究，并未在患者外周血单个核细胞(peripheral blood monouclear cells, PBMC)的CD4+T细胞进一步验证，具有一定的局限性；其次，DNA甲基化会抑制基因的表达，调控mRNA的表达，本研究只在DNA水平进行了差异性比较，并未对c-Myc、mTOR、HIF-1α基因的表达水平进行验证，在今后研究中，笔者将继续从细胞分子学、组织学等进一步验证，以支持相关结论，减少结果的偏倚。