产纤维素酶枯草芽孢杆菌Kpg酶学性质研究及对麸皮纤维素含量的影响

2019-01-16聂利波史敦胜宋洋洋王占彬

家畜生态学报 2018年12期

聂利波，李旺，史敦胜，宋洋洋，王占彬

(河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003)

中国是农业大国，每年能够生产数以万吨粮食，同时也产生大量农产品废弃物。其中的大部分都以焚烧的方式进行处理，不仅造成了环境的污染，同时也浪费了大量资源[1]。秸秆、麸皮、稻壳等产量较大，同时也是浪费最严重的，而其中的主要成分纤维素却可以作为饲料原料供畜牧业生产使用。但由于纤维素结构比较复杂，这些纤维素原料难以被动物消化吸收，同样会造成资源的浪费[2]。

纤维素酶能够将纤维素降解为可以供动物机体消化吸收的葡萄糖，为缓解畜牧业中饲料来源紧缺的局面提供可能。纤维素酶的来源十分广泛，在植物、细菌、真菌和动物体内均能分泌或生成纤维素酶[3-4]。随着科学技术的发展，尤其是分子生物技术的逐渐成熟，科技工作者通过基因重组和筛选的方式，从自然界中获得能够降解纤维素的纤维素酶基因，将其整合到特定细菌的基因组中，以便达到降解纤维素的目的。由于大多数的纤维素酶都是通过微生物分泌的，进行筛选和构建重组菌时，选择对动物机体无害的益生菌作为宿主菌，不但能促进动物机体对营养物质的消化吸收，而且对目前畜牧行业存在的抗生素滥用现象也是一种有效的抵制。

本试验的研究对象是一株源自于动物肠道的益生菌——野生型枯草芽孢杆菌(B.subtilis) LN，经过基因重组技术改造后，筛选出能够表达纤维素酶的重组菌B.subtilisKpg，通过研究其最适反应温度和最适反应pH，以及对麸皮中纤维素和真蛋白含量的影响，为重组菌B.subtilisKpg的实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种产纤维素酶的重组菌B.subtilisKpg，野生型B.subtilisLN，均由河南科技大学生物饲料和精准营养实验室保存。

1.1.2 培养基 LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂粉20 g，蒸馏水定容到1 L，121 ℃高温高压灭菌25 min。

种子培养基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，氯化钠0.5 g溶于90 mL灭菌水，待溶解完全后，定容至100 mL，121℃灭菌25 min。

固体发酵培养基：麸皮100 g，氯化铵2 g，氯化钠1 g，灭菌水60～70 mL。

1.1.3 主要试剂的配制 CMCA底物溶液：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)1 g，磷酸盐缓冲液定容至100 mL。121 ℃灭菌25 min，4 ℃保存。

DNS染液：3，5-二硝基水杨酸6.3 g定容至500 mL，45 ℃恒温水浴锅中溶解，逐步加入氢氧化钠21.0 g，不断搅拌，至完全溶解。缓慢加入四水酒石酸钠182 g，再依次加入苯酚5 g，无水亚硫酸钠5 g，置于45 ℃恒温水浴锅中，边搅拌边补灭菌水，使添加物完全溶解，定容至1 L。将配制好的溶液转移褐色瓶中，置于避光处7 d后使用。

不同pH浓度磷酸盐缓冲液的配制见表1，配制完成后以弱酸弱碱进行pH值的标定后定容至1 L。

表1 不同pH浓度磷酸盐缓冲液的配制

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的提取取实验室保存的重组菌B.subtilisKpg 20 μL均匀涂布于LB固体培养基上，37 ℃倒置培养16 h。将活化好的B.subtilisKpg挑取单菌落，接种于种子培养基中，置于37 ℃，220 r/min恒温摇床振荡培养18 h。将菌液置于4 ℃，5 000 r/min超低温离心机中离心30 min，上清液即为粗酶液。利用同样的方法制备野生型B.subtilisLN粗酶液。

1.2.1 不同温度对重组菌B.subtilisKpg纤维素酶活性的影响测定试验分为7个试验组，每组取制备好的重组菌B.subtilisKpg粗酶液1 mL，加入2 mL的CMCA底物溶液，混匀后分别置于不同反应温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)的恒温水浴锅中，水浴30 min。待水浴结束后加入2.5 mL DNS染液混匀，100 ℃沸水浴中煮沸10 min，迅速通过流水冷却至室温后用去离子水定容至25 mL。以不加酶液的相同底物为对照组，利用紫外线分光光度计在540 nm波长条件下，测定OD值。各试验组3个重复。每个温度梯度试验组均以野生型B.subtilisLN为对照。

酶活力单位规定： 50 ℃条件下，以1 mL纤维素酶粗酶液在1 min内水解羧甲基纤维素钠生成1 μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。

酶活力计算公式：

式中：X. 酶活力(U/mL)；W. 测得的吸光度值；N. 酶样所稀释的倍数；k. 葡萄糖标准曲线的斜率；T. 反应时间；M. 酶样体积；1000. mg转化为μg。

1.2.2 不同pH对重组菌B.subtilisKpg纤维素酶活性的影响测定试验分为10个试验组，每个试验组取制备好的重组菌B.subtilisKpg粗酶液1 mL，分别加入2 mL不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)配制的CMCA底物溶液，混匀后置于50 ℃恒温水浴锅中，水浴30 min。待水浴结束后加入2.5 mL DNS染液混匀，100 ℃沸水浴中煮沸10 min，迅速通过流水冷却至室温后用去离子水定容至25 mL。以不加酶液的相同底物为对照组，测定OD540值。每组3个重复，每个温度梯度试验组均以野生型B.subtilisLN为对照。

1.2.3 不同温度、pH对重组菌B.subtilisKpg纤维素酶活性的影响测定取制备好的重组菌B.subtilisKpg粗酶液1 mL，分别加入不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)配置的CMCA底物溶液，混匀后分别置于不同反应温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)恒温水浴锅中，水浴30 min。待水浴结束后加入2.5 mL DNS染液混匀，100 ℃沸水浴中煮沸10 min，迅速通过流水冷却至室温后用去离子水定容至25 mL。以不加酶液的相同底物为对照组，测定OD540值。各试验组3个重复。

1.2.4 麸皮发酵试验选择5个固体发酵培养基分别加入无菌种子培养基、重组菌B.subtilisKpg粗酶液、重组菌B.subtilisKpg菌液、野生型B.subtilisLN粗酶液和野生型B.subtilisLN菌液，添加量均为10 mL。混匀置于烧杯中，用报纸包好，并用针头扎孔，放置于37 ℃ 恒温培养箱内，静止培养6 d。每隔1 d翻动一次，并适当补水。发酵完成的培养产物置于65 ℃烘箱中进行烘干，至培养产物中水分一致。

1.2.5 发酵麸皮中纤维素和真蛋白含量的测定发酵麸皮中纤维素和真蛋白含量的测定参照《饲料分析及饲料质量检测技术》中纤维素[5]67-77和真蛋白[5]48-53的测定方法进行。

1.2.6 数据统计试验结果用Excel 2013软件进行预处理，用SPSS 19.1统计软件对数据进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较检验。

2 结果与分析

2.1 不同温度对纤维素酶活性的影响

不同反应温度下，重组菌B.subtilisKpg的纤维素酶活性均大于野生型B.subtilisLN，但两者的粗酶液随温度的变化趋势类似。反应温度为60 ℃时，酶活性最大为108.45 U/mL，与对照组相比提高了172%。超过60 ℃之后，随着反应温度的升高，重组菌B.subtilisKpg纤维素酶活性逐渐降低，反应温度到达90 ℃时，纤维素酶活最低，但依旧能表现出一定的活性，为8.80 U/mL(图1)。

2.2 不同pH对纤维素酶活性的影响

pH值为6时，重组菌B.subtilisKpg纤维素酶活性最大为97.72 U/mL，相对于野生型B.subtilisLN酶活性提高了220%。pH为3时，重组菌B.subtilisKpg和野生型B.subtilisLN的纤维素酶活性均为最低，仅为5.03 U/mL和5.65 U/mL。反应环境为弱碱时，纤维素酶的最适pH为7.5，酶活性为78.24 U/mL，随着pH值的增大，纤维素酶活性逐渐降低。在弱碱环境中，重组菌B.subtilisKpg纤维素酶仍能表现出较高的活性(图2)。试验结果显示，pH值为7时的中性环境并不是重组菌B.subtilisKpg纤维素酶的最适反应环境。

图1 不同温度对重组菌与野生菌纤维素酶活力的影响

图2 不同pH对重组菌与野生菌纤维素酶活力的影响

注：同组数据标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母者为差异不显著(P>0.05)。

Notes: In the same group, values with different lowercase letter mean significant difference (P<0.05), the same letter mean insignificant difference (P>0.05).

2.3 不同温度、pH对纤维素酶活性的影响

通过对重组菌B.subtilisKpg粗酶液在不同反应温度和不同pH环境中的酶活性测定发现，在60 ℃，pH为6.0时其酶活力最高，达到113.58±1.8 U/mL，与其他条件下相比差异显著(P<0.05)(表2)。相同温度条件下，当pH为6时，重组菌B.subtilisKpg的粗酶液活力均高于其他pH条件下的酶活力；相同pH环境下，温度为60 ℃时，重组菌B.subtilisKpg的粗酶液活力均高于其他温度条件下的酶活力。试验结果与之前所测结果相符，为重组菌B.subtilisKpg的应用提供参考。

2.4 重组菌B.subtilis Kpg对麸皮粗纤维和真蛋白含量的影响

由表3可看出，重组菌B.subtilisKpg菌液和粗酶液均能够对麸皮纤维素含量产生显著影响(P<0.05)。在不添加任何菌液和粗酶液的无菌种子培养基中，发酵后麸皮的纤维素含量为13.1%，添加重组菌粗酶液可以使麸皮中纤维素含量降低至12.2%，添加重组菌菌液可将纤维素含量降低至11.7%，与无菌种子培养基试验组相比差异显著(P<0.05)；将宿主菌添加到麸皮中，粗酶液和菌液对麸皮中纤维素含量影响不明显(P>0.05)。通过发酵麸皮试验发现，重组菌对纤维素的降解效果显著(P<0.05)，证明了重组菌B.subtilisKpg在生产实践中对纤维素酶降解的可靠性。

表2 不同温度、pH对重组菌纤维素酶活力的影响

注：同行数据肩标为不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下同。

Notes: In the same row, values with different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05) .The same below.

表3 发酵麸皮中纤维素和真蛋白成分变化

注：同行数据后肩小写字母为P<0.05时差异显著性检测，相同字母者为差异不显著。

Note::Values with different lowercase superscripts in the same line are significantly different (P<0.05), the same superscripts are insignificantly different.

由表3可看出，重组菌B.subtilisKpg和野生型B.subtilisLN均能将固体发酵培养基中的无机氮转化为有机氮，提高真蛋白含量且差异显著(P<0.05)。在不添加任何菌液和粗酶液的无菌种子培养基中，发酵后麸皮的真蛋白含量为17.4%，添加重组菌B.subtilisKpg粗酶液和野生型B.subtilisLN粗酶液的发酵麸皮，真蛋白含量提高至19.0%和19.1%，与无菌种子培养基试验组相比差异显著(P<0.05)，但两者之间无明显差异(P>0.05)；添加重组菌B.subtilisKpg和野生型B.subtilisLN的菌液也能提高发酵麸皮中真蛋白含量，且差异显著(P<0.05)。试验发现，在发酵麸皮过程中，添加粗酶液效果优于添加相应菌液。在一定的发酵时间内，B.subtilis粗酶液可以直接发挥作用，缩短了菌液生长分泌相应酶类的培养周期。

3 讨论

由于在植物中的纤维素酶含量少且难以提取，因此大多数纤维素酶的筛选都来自于微生物中。经常被科技工作者用来生产纤维素酶的微生物有青霉、曲霉、芽孢杆菌、酵母菌等[6-9]。本试验选用的研究对象是对野生型B.subtilisLN进行DNA改造后，能够分泌纤维素酶的重组菌B.subtilisKpg。野生型B.subtilisLN源自于动物肠道益生菌菌群，在生产使用中对动物机体造成的不良影响可降到最低。刘鑫[10]以藏绵羊源的产纤维素酶B.subtilis为研究对象，使用不同的抗生素进行处理，结果发现其具有良好的耐碱性、耐酸性和抗药性。本试验同样采用的是动物源B.subtilis，为重组菌B.subtilisKpg的生产应用提供理论支持。其次，B.subtilis自身对外界环境的耐受程度比较好，生存条件要求不高，便于培养[11]。在研究过程中发现，在低温、高温和强酸条件下，重组菌B.subtilisKpg分泌的纤维素酶均能表达一定的活性，证明了重组菌B.subtilisKpg具有较强的耐受性。B.subtilis表达系统能够直接将表达产物分泌到细胞外，增加了产物的回收利用效率。B.subtilis凭借自身高效的信号肽和分子伴侣系统，可以有效地提高目的蛋白的分泌量。陈大超[12]利用B.subtilis表达系统构建能够降解有机磷的新型菌株，使其分泌的酶活性提高了0.9倍。本试验选用野生型B.subtilisLN作为宿主菌，目的是为了借助B.subtilis高效的表达系统，增加纤维素酶的表达量，为生产实践提供便利。

在本研究中，通过设计不同的反应温度梯度，探索重组菌B.subtilisKpg分泌的纤维素酶表达活性，结果发现重组菌B.subtilisKpg在30～90 ℃范围内均能表现出一定活性。张伟[13]在构建产木聚糖酶B.subtilis的过程中发现，重组菌在85 ℃的高温环境中，酶活性最强，在65～95 ℃环境中，仍能保持酶活性最高时的70%，与本试验结果相似。B.subtilis在生长繁殖过程中会产生芽孢，对极端温度有较好的耐受性，可以减轻表达产物受温度、紫外线以及其他物质的破坏，保持相应的活性[14]。在饲料加工过程中，制粒时伴随着高温的产生，一般为60～80 ℃范围内，制粒时间大概1～2 min，因此需要微生物或者酶制剂具有一定耐热性[15]。重组菌B.subtilisKpg能使酶活性较强的温度集中在40～70 ℃之间，但在80 ℃时仅能表现出最高酶活性的40.1%，有待进一步改进提高。影响纤维素酶活性的因素除了温度，pH的影响也很大。在动物的消化系统中，各部位的pH大多维持在5～7.5之间，呈中性偏酸。重组菌B.subtilisKpg表达的纤维素酶在pH5.5～8之间均能表现出较高的活性，避免了纤维素酶在使用过程中失活的现象发生。刘晖[16]在纤维素酶的耐受性试验研究中发现，其纤维素酶的最佳pH环境维持在5～7之间，与本试验结果相似，但酶活性最高时是在pH为5，而在本研究中，最适pH为6，这可能与纤维素酶基因的来源不同有关。纤维素酶是由多种水解酶组合在一起形成的，不同基因来源的纤维素酶基因，其组分比例也存在差异，因此对最适环境也会存在差异[17-18]。

在固体发酵试验中，选用麸皮为发酵原料，麸皮自身纤维素含量较高，且每年我国的麸皮产量很大[19]。研究重组菌B.subtilisKpg对麸皮的影响，对合理运用麸皮具有一定的意义。通过试验发现重组菌B.subtilisKpg可以降低麸皮中的纤维素含量，效果显著(P<0.05)，同时还能够显著提高真蛋白的合成(P<0.05)。崔晨晓[20]在研究酵母菌发酵对小麦麸皮含量的影响中发现，酵母菌35 ℃发酵48 h条件下能使麸皮中的膳食纤维含量降低6.45%，真蛋白含量提高21.97%。在本试验中，重组菌B.subtilisKpg可以将麸皮纤维素降低10.7%，B.subtilis在发酵过程中利用纤维素酶可以破坏纤维素的结构，使其水解为单糖，降低纤维素含量。但在真蛋白的提高上效果不如酵母菌，仅提高9.2%。这是由于酵母菌更适合在麸皮基质中生长，在生长过程中将麸皮中的无机氮转化有机氮[21]。试验过程中还发现，发酵过程中，添加重组菌B.subtilisKpg菌液对麸皮中纤维素的降解最好，添加重组菌B.subtilisKpg粗酶液对麸皮中的真蛋白提高效果也是最好。因为在降解纤维素的过程中，添加菌液可以增加纤维素酶的表达量。但是，纤维素酶对真蛋白的转化却无明显作用，真蛋白含量的提高，只能依靠B.subtilis自身生长过程中表达或分泌的某种产物。同时在细菌生长过程中，也会消耗掉一部分的真蛋白，因此直接添加粗酶液，减少了细菌对真蛋白的利用，提升效果优于直接添加菌液[22]。