建立5种医院制剂微生物限度检查法
2019-01-16吴宏扬袁巍
吴宏扬 袁巍
《中国药典》2015年版颁布执行后,药品微生物限度检查法在检查内容、检查方法、培养体系等方面都发生了很大变化。本文对我辖区内五种医院制剂芪穹止痛胶囊、平喘胶囊、芪蛤止哮胶囊、仙芪生血颗粒、羚黄凉血颗粒,根据《中国药典》2015年版四部非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法(通则1105)、非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查(通则1106)、非无菌药品微生物限度标准(通则1107)[1]进行微生物限度检查方法的验证研究,并且考察两种稀释剂对试验结果的影响,建立其完善的微生物限度检查法,以确保检验结果的准确性,更好的控制产品的质量安全性和稳定性。
1 仪器材料
1.1 仪器
立式高压蒸汽灭菌器(型号:LDZX-75KBS厂家:上海申安医疗器械厂),生物安全柜(型号:BHC-1300ⅡA型 厂家:苏净集团),恒温培养箱(型号:IPP110 PLUS厂家:德国美墨尔特)电子天平(型号:pl1002e厂家:梅特勒-托利多)一次性预灭菌平皿(厂家:北京陆桥)。
1.2 培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基(批号:1 51230),沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号:151219),沙氏葡萄糖液体培养基(批号:150916),胰酪大豆胨液体培养基(批号:151228),肠道菌增菌液体培养基(批号:151204),麦康凯琼脂培养基(批号:151124)麦康凯液体培养基(批号:151204)、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基(批号:151217)、RV沙门菌增菌液液体培养基(批号:151206)、木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂培养基(批号:151210),厂家均为北京陆桥技术有限公司。
1.3 菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003](产品号33025)、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501](产品号:33031)、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104](产品号:33034)、白色念珠菌[CMCC(F)98001](产品号:33045)、黑曲霉[CMCC(F)98003](33062)(33028)、沙门氏菌[CMCC(B)50001](33027)厂家均为北京三药科技开发公司。
1.4 稀释液及冲洗液
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号:150518)、胰酪大豆胨液体培养基(批号:151228)厂家均为北京陆桥技术有限公司。
1.5 样品
芪穹止痛胶囊、平喘胶囊、芪蛤止哮胶囊、仙芪生血颗粒、羚黄凉血颗粒各3批。
2 方法与结果
按照《中国药典》2015年版四部非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法(通则1105)和非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法(通则1106)的有关规定,对上述样品进行方法适用性试验。
2.1 试验用菌液体制备
按照菌株产品使用说明书,将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、沙门氏菌球,分别用复溶液复溶后,稀释至小于100 cfu/ml备用。
2.2 供试品制备
分别称取各个样品10 g,分别置pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液和胰酪大豆胨液体培养基各100 ml中,制成1:10供试品液。再稀释成1:100和1:1 000供试品液备用。
2.3 计数方法适用性试验
2.3.1 需氧菌总数 平皿法:试验组:各取1:10供试品液10 ml,于灭菌试管中,加入相应试验菌液0.1 ml使其最终浓度为每1 ml不大于100 cfu菌液,混匀,从试管中吸取1 ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨培养基,待凝固,倒置,每株试验菌株平行制备2个平皿,在30℃培养5天,测定计数,作为试验组菌落数。
菌液对照组:以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液和胰酪大豆胨液体培养基10 ml分别代替供试品,按试验组操作加入试验菌液,混匀,同法每株菌制备2个平皿,在30℃培养5天,测定计数,作为菌液对照组菌落数。
供试品对照组:取制备好的1:10供试品液10 ml,以相应稀释液0.1 ml代替试液菌液,按照试验组操作,测定计数,作为供试品对照组菌落数。
表1 五种医院制剂的需氧菌分析
表2 五种医院制剂的菌液分析
分别按照公式:(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液对照组的平均菌落数=回收率[2],结果见表1。
2.3.2 霉菌和酵母菌总数 平皿法:
试验组:吸取相应需氧菌总数供试品试验组供试液1 ml注入平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基,待凝固[3],每株试验菌株平行制备2个平皿,在25℃培养7天,测定计数,作为试验组菌落数。
菌液对照组:以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液和胰酪大豆胨液体培养基10 ml分别代替供试品,按需氧菌总数试验组操作加入相应试验菌液[4-6],混匀,同法每株菌制备2个平皿,在25℃培养7天,测定计数,作为菌液对照组菌落数。
供试品对照组:制备好的1:10供试品液10 ml,以相应稀释液0.1 ml代替试液菌液,按照试验组操作,测定计数,作为供试品对照组菌落数。
按照公式:(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液对照组的平均菌落数=回收率,结果见表2。
2.3.3 控制菌检查 耐胆盐革兰氏阴性菌:分别取培养后的1:10供试液各1 ml,大肠埃希菌菌悬液1 ml及铜绿假单胞菌菌悬液1 ml,加至10 ml的肠道增菌液培养基中,按耐胆盐革兰氏阴性菌的检查法进行适用性试验。
大肠埃希菌:各取1:10供试品液10 ml及大肠埃希菌菌悬液1 ml,加至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中,混匀,按照相应的控制菌项下检查法进行适用性试验。
沙门菌:取供试品10 g,接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中,加入沙门氏菌菌悬液1 ml,混匀,按照沙门菌项下检查法进行适用性试验。
结果:五种样品的三种控制菌均用常规法检出。
3 讨论
由2.3项下试验结果表明,五种医院制剂均可采用平皿方法进行需氧总数,霉菌和酵母菌总数检验。耐胆盐革兰氏阴性菌、大肠埃希菌[7-10]、沙门菌等控制菌检查均可采用常规方法进行检测。
《中国药典》2015年版药典实施后,稀释液种类由原来的基础上增加了胰酪大豆液体培养基,本验证试验方法对pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和胰酪大豆液体培养基两种稀释液进行了对比考察,试验表明使用两种稀释液对上述五种供试品的检验结果均无影响。从实际操作中看,使用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释液,更有利于实验步骤的简化,方便后续控制菌检查的开展,微生物计数与控制菌检查第一步可以同时进行,减少供试品的使用量和检验周期,增加工作效率。
《中国药典》2015年版药典实施后,微生物计数改为需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数,用选择性相对低的胰酪大豆胨琼脂培养基替代营养琼脂,沙氏琼脂培养基替换选择性相对强的玫瑰红钠琼脂,按微生物培养条件分类,需氧菌总数指在胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的全部菌落数,包括真菌菌落数;霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂上生长的所有菌落数,包括细菌菌落数。这样修改避免了实验者区分细菌和酵母菌霉菌,能有效减少实验室之间,检验者之间对实验结果造成误差,减少人为因素,更能真实体现样品污染程度。
控制菌检查项目将大肠菌群改为耐胆盐革兰氏阴性菌,并采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌,增加预增菌过程。使用无选择性的增菌培养基预培养后,可以使受损伤的细菌得到修复,从而提高检出率,降低误检和漏检。
验证方法中采用供试品溶液中加入试验菌[11-13],且方法回收率改为0.5~2,合理考虑各方面的影响,符合微生物生长的习性,降低了回收试验的难度,使验证试验和检验方法更简便可靠。