发酵食品中羧甲基赖氨酸的研究进展

曹卫，徐阳鑫，贺婷，陈媛媛，冯年捷，吴茜*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068；2.工业发酵湖北省协同创新中心，武汉 430068；3.湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068；4.湖北工业大学 材料与化学工程学院，武汉 430068)

发酵食品是指人们利用有益微生物加工制造的一类食品，常见的发酵食品主要有乳类发酵制品、谷物发酵制品和豆类发酵制品，并且它们的消耗量大，是人们经常食用的一类食品，其富含氨基酸、多肽、蛋白质、糖类等营养物质，对人体健康有很大的益处。但是，在发酵过程中很容易发生美拉德反应从而产生AGEs，如CML就是其中的一种，这些物质在人体内大量积累会对人体造成潜在的危害，因此，了解发酵食品中CML的形成和对其进行控制至关重要。

美拉德反应主要指食品中的氨基化合物与羰基化合物之间发生的复杂反应[1]，在非酶促条件下，还原糖(主要是葡萄糖)的醛基和蛋白质、氨基酸、脂类等大分子物质的游离氨基发生羰氨反应，经过脱水缩合、聚合、裂解、氧化修饰后产生一组稳定的AGEs[2]。食品中的AGEs主要通过美拉德反应和脂质氧化过程形成[3]，但是在发酵食品中也能够发现一定量的AGEs。AGEs包含的种类很多，除了CML外，还含有羧乙基赖氨酸(Nε-(Carboxyethyl)lysine，CEL)和吡咯素等[4]。只有对AGEs这一类化合物形成的条件进行深入的研究，并找出相应条件影响其形成反应速率的规律，才能更加有效地控制其在发酵食品中的含量。

1 CML的介绍及测定方法

1.1 CML的介绍

在与美拉德反应相关的检测AGEs的研究中，CML因为具有易标记、易检测的特点，作为在食品加工过程中出现美拉德反应时体内还原糖氧化或者修饰蛋白，羰基化合物形成或脂质氧化的重要标记产物，所以食品体系中总AGEs含量的高低就由CML含量的高低来评价。CML广泛存在于日常生活中，常见的如老抽、黄酒、豆豉等发酵食品中，被消化吸收后蓄积在肝脏、神经细胞、心肌等组织器官中，会导致一些疾病的发生。CML的化学结构式见图1。

图1 CML的化学结构式

形成CML的途径非常复杂，有广泛的底物来源，可作为形成CML的底物如蛋白质、还原糖、脂质和抗坏血酸等[5]。在发酵食品生产加工过程中CML很容易形成，它的形成是多种因素共同作用的结果，CML的形成不仅是单一的一条途径，而且由不同途径最终形成。

1.2 CML的测定方法

目前，CML的检测方法有很多，主要有酶联免疫法(ELISA)[6]、气相色谱-质谱(GC-MS)法和超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)法。

1.2.1 酶联免疫法(ELISA)

ELISA法是基于免疫学原理且在检测AGEs方面应用已很广泛，其基本原理主要是通过抗体(单克隆与多克隆)与待测物、固相抗原发生竞争结合反应来测定目标物含量。ELISA是一种快速、价廉、操作简便的CML检测方法，近年来，ELISA在食源性CML的检测中得到逐步应用。Teresia等[7]采用ELISA法对500余种食品中的CML进行检测，从检测结果来看，食品自身的营养成分和食品制作时的加工工艺对AGEs的产生会有非常大的影响。发酵食品富含蛋白质等营养成分，在发酵过程中易形成CML；而且CML随温度的升高而升高，一些发酵食品在发酵过程中也会涉及到高温的过程，在高温过程中就会积累大量的CML。ELISA法虽然具有上述提到的操作方式简便、花费时间少、成本低的优点，却也有许多缺点，例如最终结果没有标准的单位来反映；另外，ELISA法在检测过程中每个化合物都需要有特异性抗体来竞争结合，并且检测时样品的基质会影响特异性检测的结果，最终会导致CML含量的测定结果不够精确。

1.2.2 气相色谱-质谱(GC-MS)法

GC-MS法作为一种检测食源性CML的仪器分析方法，具有高分辨率、高灵敏度、高效的优点；但同时也有许多缺点，在应用GC-MS法时，除需要对食品样品进行繁琐的前处理步骤外，还需对样品进行衍生化处理，这些操作若没有完成或者存在操作错误，都会导致最终结果的不准确性，但不得不承认GC-MS法在检测CML的含量方面具有独到之处。Charissou等[8]在检测食源性CML的研究中，对食品样品首先进行脱脂、酸水解处理得到游离态CML，而后对CML进行衍生化处理，即利用三氟乙酸酐衍生化CML上的氨基，利用甲醇在强酸条件下酯化CML上的羧基，最后用GC-MS法检测衍生化后的CML，所测得的结果较为准确，此法比ELISA法的精确性高。

1.2.3 超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)法

如今，超高效液相色谱(UPLC)法也应用于检测食品中的CML，与质谱仪联用后，UPLC-MS法的灵敏度、选择性和速度比高效液相色谱(HPLC)法优得多。所以，为了进一步提高精确性、选择性和灵敏性，在检测食品样品中的CML时，UPLC与质谱仪串联使用。检测食品中CML含量的UPLC-MS法是由Assar等[9]创立的，运用此方法对许多食品样品进行过检测，应用广泛。而且质谱仪的检出限较低，加上监测的模式多，能同时定量分析体系中的不同种物质。

2 加工条件对发酵食品中羧甲基赖氨酸的影响

2.1 温度对CML的影响

加热温度通过影响反应物的活性而影响CML的形成，在此基础上，较高的温度还能加快果糖降解的速率，从而产生更多的C2，C3活性碎片，而这些碎片较果糖有更高的反应活性，它们随体系加热温度的升高而增加，造成CML的含量也随之增多；因此，控制加热温度对于抑制CML的形成有重要作用[10]。

周建弟等[11]在研究中发现，温度对美拉德反应的影响较大，一般温度在30 ℃以上，其反应速度较快；若温度相差10 ℃，其反应速度可相差3～5倍；而在20 ℃以下，温度的波动则对美拉德反应的影响不太明显。黄酒也是发酵产品的一种，在各个酿造阶段的过程中，所需的温度比较高，较高的温度条件非常有利于加快美拉德反应的速率，从而形成较多的CML。孙佳贺等[12]在对白汤酱油储藏期间褐变与美拉德反应的关系研究中发现，低温储藏能明显抑制白汤酱油颜色变深，是因为低温可以抑制美拉德反应形成CML。

2.2 pH对CML的影响

在CML反应体系中，pH对反应底物的活性影响很大，如赖氨酸的脱质子化、反应物果糖的开环式等活化形式会随pH的升高而增强，从而使美拉德反应速率加快。刘春霞等研究发现，在CML反应体系中，酸碱条件会影响反应体系产生的自由基的活性，而实验证实活性更强的自由基产生在碱性环境下，因此CML的形成在碱性条件下更容易。周燕琼[13]在研究中发现，在果糖与赖氨酸体系中，随着反应的进行，碱性赖氨酸的消耗导致pH降低，赖氨酸的脱质子化、反应物果糖的开环式等活化形式程度降低，减缓了反应速率。

刘晓庚等[14]在研究中发现，在弱酸性条件下有利于美拉德反应的进行，从而造成CML的积累，氨基酸和还原糖在强酸和强碱环境下分解速率加快，分解程度加深，而且强酸和强碱还会破坏美拉德反应生成的产物。周建弟等在研究中发现，酒体pH值对反应的影响表现在当糖类与氨基酸共存时，pH>3时，其反应速度随pH值的升高而加快。魏桃英等[15]在研究中发现，美拉德反应可以在任何酸碱环境中包括中性条件下发生，但pH>3时，随着pH的增加，反应速率会随之增大；因此，在黄酒酿造过程中要确保pH在3.5～4.8之间，其原因是保证该酸性条件下对美拉德反应的促进作用。

2.3 时间对CML的影响

因为美拉德反应极其复杂，存在很多可逆反应，在一定的温度条件下，随着加热时间的延长，CML含量先上升后基本不变，反应后期可逆反应达到平衡状态。因此在食品热加工过程中，尽量减少食品的加热时间，减少食品的加工步骤，可有效减少食品中CML的含量，同时，要尽早食用加工好的成品。

魏桃英等研究发现，绍兴黄酒在生产过程中，在一定条件下，温度越高、时间越长，美拉德反应越强烈。例如在瓶装酒杀菌过程中，由于反应底物充足，会进一步发生美拉德反应，加之这一过程持续时间比较长，反应更加剧烈。

3 羧甲基赖氨酸的控制方法

3.1 发酵食品中底物对CML形成的控制方法

3.1.1 反应底物中蛋白质对CML的控制

蛋白质作为形成CML的主要底物，在对食品热处理的过程中，CML的形成会因其种类和数量的差别而产生较大的差异，尤其是不同种类的蛋白质对CML含量的影响尤为明显，并通过实验证明了在谷蛋白、酪蛋白、大豆蛋白和牛血清蛋白4种蛋白质中，形成CML的量会依次增高。当以丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸以及天冬氨酸等其他氨基酸作为反应底物时，实验结果表明CML的形成量很低。但是作为形成CML的重要底物的赖氨酸，它对CML的形成具有决定性的作用，蛋白质含有的赖氨酸残基数量决定了CML的生成量。

周建弟等在研究中发现，氨基类化合物包括蛋白质、肽类、胺、氨基酸等，在这些化合物中因含有还原性的氨基末端而易于和还原糖反应，其中胺类的相关反应速度是最快的；其次为氨基酸，在众多氨基酸中，碱性氨基酸的反应比其他氨基酸的都要快；蛋白质由于其本身的氨基暴露的程度较小，它的反应速率比肽类和氨基酸都要慢。孙佳贺等在对白汤酱油储藏期间褐变与美拉德反应的关系研究中发现，酱醪发酵过程中氨基酸对酱醪色泽影响的强弱次序为酸性氨基酸>中性氨基酸>碱性氨基酸。

3.1.2 反应底物中还原糖对CML的控制

大量的研究实验证明，还原糖均可以与赖氨酸反应生成CML。Ruttkat等[16]建立了4种不同的还原糖与赖氨酸生成CML的模拟反应体系，经检测发现，4种还原糖的模拟反应体系均能生成CML，而且在果糖、山梨糖、葡糖糖和半乳糖4种反应体系中形成CML的数量依次升高。Li等[17]建立了3种糖与赖氨酸生成CML的模拟反应体系，结果发现在蔗糖、葡萄糖和乳糖这3种反应体系中形成CML的量依次增大。但是 Sakai等[18]指出，果糖的糖基化能力比葡萄糖更强；Hinton等[19]的研究也表明，在葡萄糖-牛血清白蛋白体系中产生的CML含量要低于果糖-牛血清白蛋白体系。因此，是在果糖中生成的CML含量高还是在葡萄糖中生成的CML含量高，针对此研究结果目前还存在一些差异性，想要得到更确切的结果还需要进一步的研究。此外，Wu Qian等[20]研究发现，高糖环境能够加速非酶糖基化和葡萄糖自氧化产生CML，抑制消化道中碳水化合物水解酶(α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶)的活性来延迟葡萄糖的吸收，从而抑制CML的形成。

庄名扬[21]在研究中发现，酿酒原料小麦、高粱、玉米等中的淀粉、纤维素在各类淀粉水解酶、纤维素酶等的作用下，生成各类单糖，反应速率为五碳糖>六碳糖，而六碳糖的反应速率则为半乳糖>甘露糖>葡萄糖。孙佳贺等在研究中发现，六碳糖的美拉德反应速度大概只有五碳糖的1/10。六碳糖相对于五碳糖来说碳链较长，所以碳架空间位阻效应大，因此其反应活性低，不利于反应的进行。总的来说，还原糖的还原性越大，反应活性越大，在同等条件下，越有利于CML的形成。所以，为了降低CML的含量，应采用还原性较小的糖类作为反应原料。

3.2 通过添加外源添加剂对CML的控制

研究表明，通过加入一些外源添加剂可以控制CML的形成。例如，柠檬酸是一种酸度调节剂，通常在食品的生产加工过程中，为了抑制CML的形成，可以通过添加适量的柠檬酸来调节食品体系的酸碱度。赖氨酸在碱性环境中会发生脱质子化反应形成具有更高反应活性的自由基，利于CML的生成；相反，酸性环境中会抑制赖氨酸变成具有较强反应活性的自由基，因此导致CML的形成受阻。

硼氢化钠(NaBH4)是化学合成抗氧化剂中最常用的CML抑制剂，它之所以作为最常用的抑制剂是因为其具有很强的选择性还原，它的分子结构中有4个呈-1价的H原子，可以将酮类、醛类和酰氯类等羰基化合物中的羰基选择还原成羟基。NaBH4能够通过还原CML的中间产物乙二醛(GO)和果糖赖氨酸(FL)来抑制CML的形成。付全意[22]对葡萄糖-赖氨酸模拟反应体系的研究发现，NaBH4不仅能够还原CML的中间产物GO，而且还可以将形成CML的主要中间产物FL还原，终止其氧化裂解生成CML，从而抑制CML的形成。

部分天然抗氧化剂能够有效抑制食品体系中CML的形成。付全意研究发现，黄酮类物质芦丁对GO和FL生成CML以及葡萄糖向GO和FL的转化均具有抑制作用。Zhang等[23]研究发现，多酚类化合物可通过结合CML的中间产物GO及清除自由基的方式对葡萄糖-酪蛋白模拟反应体系CML的形成发挥抑制作用。李晓明等[24]研究发现，芦丁能够有效抑制分别由活性二羰基化合物和还原糖引发的蛋白糖基化反应。孙涛等[25]研究发现，槲皮素对晚期糖基化产物表现出显著的抑制作用，且抑制作用强于氨基胍。Peng等[26]从肉桂皮中提取得到了表儿茶素和原花青素B2，通过实验证明这2种物质能够有效抑制CML的生成，尤其是原花青素B2还可以通过捕获CML形成过程中的中间产物GO从而阻断CML的形成；在此之后，Peng等[27]又研究发现葡萄籽提取物富含的原花青素和儿茶素具有很强的抗氧化性，可以清除食品体系中CML生成的中间产物 GO。Wu Qian等[28]研究发现，莲房原花青素(LSOPC)可以抑制美拉德反应中CML的形成。Shen Yixiao等[29]在研究中发现白藜芦醇可以通过共轭反应抑制甲基乙二醛(MGO)，从而进一步抑制糖化反应；Wang Weixin等[30]研究发现，从山茶花中提取的植物化学物质通过清除甲基乙二醛抑制了高级糖化最终产物的形成。因此，在发酵食品的实际生产过程中，经常添加这些外源添加剂来控制CML的形成，从而保证产品的品质。

3.3 通过控制加工工艺条件控制CML的形成

加热温度、加热时间、水分含量等加工条件对CML的形成有很重要和直接的影响，例如相同的食物原料经高温、低湿加工产生的含量比低温、高湿处理产生的CML含量高很多。因此，通过改善食品加工工艺条件可以更直接地达到对CML形成的抑制效果。实验结果表明CML的含量虽然与加热时间有一定的相关性，但是与加热温度之间是非线性关系，在碱性环境中更利于CML的生成，在高温的加工条件下，会加剧CML的生成，因此，在实际生产过程中可以通过控制这些加工条件来控制发酵食品中CML的形成，主要的控制途径有以下3个方面：一是降低食品加工温度；二是缩短食品加工时间；三是减少食品加工步骤。

4 CML对人体产生的危害

CML在发酵食品中的危害主要体现在对人体健康的影响，其被人体摄入后，对人体会造成不可修复的慢性损伤。

从医学界的研究中发现，AGEs可累积于人体不同的组织和器官中，当AGEs的累积量达到或超过一定阈值时，会诱发糖尿病[31,32]、尿毒症[33]、阿尔兹海默症[34]等，而且会使这些病情加重。而CML作为AGEs的典型代表物，同样可以累积于人体内不同的组织和器官中，产生上述疾病，还有诸如肾衰竭(renal failure)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)[35]、慢性心力衰竭等。

这些研究表明控制发酵食品中CML的含量势在必行，发酵食品是我国日常生活中不可或缺的食品，例如生活中常用的调味品老抽，其中的CML含量为游离态CML：(796.35±24.67) g/mL食品；结合态CML：(0.97±0.11) g/mL食品。这些发酵食品的摄入同时也造成我国居民对CML的摄入量增加，导致我国居民的健康水平下降，使人体慢性疾病的发病概率增大。

5 总结

发酵食品是我们日常生活中必不可少的食品，而其中美拉德反应所产生的AGEs是一直以来的热门科研项目，CML作为AGEs的典型代表物更是被广泛关注与研究。

经过多年的研究，CML的形成机理、对人体的危害性、控制方法都已经被逐步研究，而且检测方法多种多样，如ELISA法、GC-MS法和UPLC-MS法等，这些方法在操作复杂程度上、精度上、效率上都不尽相同，需要根据自己的需求来选取不同的检测方法。

CML的形成机理较为复杂，CML的形成受到许多因素的综合作用，比如热加工处理方式、加热时间、加热温度等。而通过研究发现，CML与许多疾病的发生密切相关，能促进多种疾病的发生。控制发酵食品中CML的含量可以从3个主要的方向进行：一是通过控制发酵食品中蛋白质的含量即CML的底物含量；二是可以通过添加一些有效的外源添加剂；三是可以通过控制加工工艺条件来控制CML的形成。对于发酵食品中CML的控制，还存在许多有待研究的方面，因为CML在发酵食品中的形成过程是一个动态平衡过程，现在的研究模型较为简单，要建立更加有效的抑制途径需要一个完善的模型。