阴部神经电刺激对大鼠膀胱过度活动症的治疗作用

金梅 蒋秀婵 陈涓涓 李香娟 徐智慧

膀胱过度活动症（overactive bladder，OAB）是一种以尿急为特征的症候群，发病率高，常伴有急迫性尿失禁、尿频和夜尿增多等症状，严重影响患者生活质量和身心健康[1-2]。OAB发病机制包括中枢神经系统、外周神经系统等不同水平神经控制及膀胱平滑肌本身的抑制失控和异常兴奋，其治疗目的在于达到接近生理的膀胱充盈和排尿状态，改善下尿道功能，提高生活质量[3]。OAB的治疗方式包括行为治疗、药物治疗和手术治疗等。行为治疗需长期坚持，疗效缓慢。抗胆碱能药物治疗会产生口干、便秘、眩晕、认知障碍等不良反应，常使患者中断治疗，病情反复恶化，加大治疗难度[1,4]。因此寻找一种安全有效、不良反应小、治疗满意度高的治疗方法一直是临床研究的热点。电刺激治疗始于20世纪50年代，1984年Fall[5]经阴部神经电刺激治疗尿失禁并取得一定的疗效，阴部神经电刺激治疗是通过电刺激神经来调控膀胱和尿道的功能[6]。目前关于阴部神经电刺激对OAB治疗是否有效的研究较少，前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）大鼠 OAB模型与人类 OAB的发病机制、排尿频率和膀胱容量的减少程度[7]相似。本研究观察阴部神经电刺激在PGE2大鼠OAB模型中的治疗作用，以验证阴部神经电刺激是否会增加模型大鼠的膀胱容量。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雌性SD大鼠17只，体质量235~360（274±27.06）g，采用乌拉坦（1.2g/kg）皮下注射麻醉。使用食管温度探测器监测体温，并用再循环水毯使大鼠体温保持在36~38℃。使用脉搏血氧计（燕牌2500A，美国NONIN公司）监测心率和动脉血氧饱和度水平。

1.2 试剂与仪器 输液泵（PHD 4400）购自美国Harvard Apparatus公司；压力传感器（ArgoTrans）购自美国Argon公司；双极袖套电极（200μm）购自德国CorTec GmbH公司；模拟刺激隔离器（Model 2200）购自美国AM Systems公司；前置放大器（HIP5）购自美国Grass Products公司；PGE2（货号 U108629-25G）购自英国Tocris Bioscience公司；氨基甲酸乙酯（货号 U2500-500G）、乌拉坦（货号 94300-50G）购自美国 Sigma-Aldrich公司。

1.3 药物制备 称取10mg PGE2于2.837ml无水乙醇中重新配制成10mmol/L储备溶液，置于-20℃冰箱中储存。取300μmol/L PGE2储备溶液，用0.9%氯化钠溶液稀释100倍制备成100μmol/L PGE2溶液，此浓度在膀胱内灌注时能有效降低膀胱容量[8]。300μl无水乙醇加入0.9%氯化钠溶液配成30ml溶液，即空白基质溶液。

1.4 实验分组处理 通过腹部正中切口暴露膀胱，将PE-90聚乙烯导管（其末端被加热以形成颈圈）通过膀胱顶端的小切口插入膀胱内腔，并用6-0丝线在颈圈周围缝合。将膀胱导管通过三通旋塞连接到输液泵与Gould传感器信号调节器连接的压力传感器上来测量膀胱内压。采用随机数字表法将大鼠分为PGE2组11只和空白基质溶液组6只，PGE2组向膀胱内连续灌注100μmol/L PGE2溶液，空白基质溶液组向膀胱内连续灌注空白基质溶液，记录两组大鼠灌注前后膀胱测压（cystometrogram，CMG）参数。每次CMG结束后排空膀胱，停止灌注，使逼尿肌松弛5~10min后重复测压，CMG数据至少重复记录3次。之后PGE2组大鼠排空膀胱，阴部神经电刺激膀胱，记录CMG参数。

1.5 观察指标

1.5.1 持续膀胱压力测定 按1.4实验方法测量膀胱内压，向所有大鼠膀胱连续灌注0.9%氯化钠溶液，在膀胱出现自主排尿前停止膀胱灌注。当出现规律的排尿时，持续记录1h。

1.5.2 膀胱容量测定 灌注开始到结束时注入膀胱内液体的量即为膀胱容量。记录两组大鼠排尿体积和残尿体积，排尿效率=排尿体积/膀胱容量×100%。最大收缩压、收缩持续时间和膀胱收缩AUC于排尿收缩开始到排空结束的时间内计算。

1.6 CMG和尿道外括约肌（EUS）肌电图（EMG）参数测量方法 置好膀胱导管后，使用相同的腹侧入路，使左侧阴部神经单侧暴露，双极袖套式电极包裹后连接模拟刺激器（图1a）。双极桨式电极（图1b）放置于EUS的位置，并与前置放大器相连来进行同步EUS EMG测定。使用PowerLab/16SP采集单元对膀胱内压和EUS EMG信号进行放大、过滤和采样，以1000或20000Hz采样，并使用LabChart 7软件进行离线分析。EUS EMG测量的时间是从膀胱充盈到膀胱收缩。

阴部神经电刺激实验中，选择两个不同频率（1和10Hz）和振幅（0.8和1.0T）的双相恒定脉冲电流（波宽为 0.1ms），其中T（即 Threshold）是引起 EUS EMG 反射活动的阈值（图1c-d），是每个刺激脉冲诱发EMG的最小强度。

图1 阴部神经电刺激乌拉坦麻醉的大鼠产生EUS EMG（a：阴部神经电刺激电极放置示意图；b：记录EUS EMG的定制双极桨式电极；c：阴部神经电刺激以1Hz诱发EUS EMG运动反应所需阈值的示例；d：阴部神经电刺激以1Hz诱发EUS EMG运动反应所需阈值的0.8倍示例）

1.7 统计学处理 采用GraphPad Prism 6统计软件。计量资料以表示，组内比较采用配对t检验；为了比较空白基质和PGE2的作用，将两组灌注空白基质和PGE2后数据除以灌注前数据的比值进行log对数转换，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PGE2对CMG参数和EUS EMG的作用 与灌注前相比，灌注后PGE2组大鼠膀胱容量降低，排尿效率增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；但灌注前后最大收缩压、收缩持续时间、膀胱收缩AUC和EUS EMG比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图2和表1。

图2 PGE2组大鼠灌注100μmol/L PGE2溶液前后膀胱压力和EUS EMG参数图[a：PGE2溶液灌注前膀胱压力（上）和EUS EMG（下）；b：从（a）的展开轨迹证实膀胱压力（上）和EUS EMG（下）在排尿期间存在高频振荡；c：PGE2溶液灌注后膀胱压力（上）和EUS EMG（下）；d：从（c）的展开轨迹显示膀胱压力（上）和EUS EMG（下）在排尿期间存在高频振荡]

表1 PGE2组大鼠灌注PGE2溶液前后CMG参数和EUS EMG比较（n=11）

2.2 空白基质对CMG参数和EUS EMG的作用 与灌注前相比，灌注后空白基质溶液组大鼠最大收缩压明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；但灌注前后膀胱容量、排尿效率、收缩持续时间、膀胱收缩AUC和 EUS EMG比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图3和表2。

2.3 PGE2和空白基质对CMG参数和EUS EMG的作用比较 经log对数转换后，PGE2组膀胱容量明显低于空白基质溶液组，最大收缩压明显高于空白基质溶液组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），证实PGE2对膀胱容量有影响。但两组大鼠排尿效率、收缩持续时间、膀胱收缩AUC和EUS EMG比较差异均无统计学意义（均P＞ 0.05），见表3。

2.4 阴部神经电刺激对PGE2组大鼠CMG参数和EUS EMG的影响 引起盆腔EUS EMG反射的最小刺激振幅（图1c-d）为29~256（107.0±76.3）μA，平均潜伏期（17.5±2.3）ms。PGE2组大鼠阴部神经电刺激前后膀胱压力和EUS EMG参数见图4。与灌注PGE2相比，10Hz和1.0T的阴部神经电刺激明显使膀胱容量和EUS EMG肌电压增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。阴部神经电刺激对排尿效率、最大收缩压力、收缩持续时间和膀胱收缩AUC均无明显影响（均P＞0.05），见表4。

3 讨论

图3 空白基质溶液组大鼠灌注空白基质溶液前后膀胱压力和EUS EMG参数图[a：空白基质溶液灌注前膀胱压力（上）和EUS EMG（下）；b：从（a）的展开轨迹显示膀胱压力（上）和EUS EMG（下）在排尿期间存在高频振荡；c：空白基质溶液灌注后膀胱压力（上）和EUS EMG（下）；d：从（c）的展开轨迹显示膀胱压力（上）和EUS EMG（下）在排尿期间存在高频振荡]

表2 空白基质溶液组大鼠灌注空白基质溶液前后CMG参数和 EUS EMG 比较（n=6）

表3 两组大鼠CMG参数和EUS EMG比较

向膀胱灌注100μmol/L PGE2后，乌拉坦麻醉过的雌性大鼠膀胱容量减少。与灌注空白基质相比，灌注PGE2后膀胱容量明显减少，证实PGE2介导了膀胱容量的变化。虽然在乌拉坦麻醉下进行，这些结果与其他研究报道的PGE2膀胱灌注清醒大鼠和人类后的膀胱容量减少情况一致[8-9]。PGE2对排尿效率的影响尚未报道，但Aizawa等[7]和Ishizuka等[10]记录了清醒大鼠的排尿量，间接地进行了排尿效率（排尿量/膀胱容量）比较，膀胱内灌注10和50μmol/L PGE2前后的平均排尿效率分别为 96%和91%（n=20，Aizawa等），88%和 84%（n=12，Ishizuka等）。实验中证实膀胱内灌注PGE2后排尿效率增加，但其效果与空白基质溶液组比较差异无统计学意义，表明空白基质与PGE2之间的相互作用可能导致了排尿效率的变化。这两项研究进一步支持了本研究结果。本研究排尿效率与在大鼠清醒时间接计算的排尿效率相比较低，可能与乌拉坦麻醉可以降低排尿效率有关[11]。本研究观察到灌注PGE2前后最大收缩压、收缩持续时间、膀胱收缩AUC比较差异均无统计学意义，表明灌注PGE2后膀胱没有像排尿一样强烈地收缩。因此，笔者假设PGE2降低了尿道出口阻力，从而促进了排尿的增加。

以往研究中阴部神经电刺激的效果很少集中在增强膀胱收缩，并且尚未研究用阴部神经电刺激治疗OAB。本研究表明通过适当的阴部神经电刺激（10Hz、1.0T）后显著增加了大鼠膀胱容量，但对排尿效率、最大收缩压力、收缩持续时间和膀胱收缩AUC均无明显影响。同样观察到EUS EMG在10Hz、1.0T的阴部神经电刺激下显著增加，但是诱发的EUS反射活动却比1Hz、1.0T少。这种频率依赖性下降与其他研究报道的阴部神经电刺激期间EUS减弱一致[12-13]。研究结果表明，阴部神经电刺激可能通过增加尿道出口阻力而不是通过EUS的直接反射活动。

表4 阴部神经电刺激对PGE2组大鼠CMG参数和EUS EMG的影响（n=11）

尽管阴部神经电刺激抵消了PGE2诱导的出口阻力，但这一机制本身并不能完全解释受阴部神经电刺激而增加的膀胱容量。疼痛理论[14]提供了阴部神经电刺激如何缓解OAB的解释，通过将该理论应用于下尿路，可推测阴部神经电神经刺激可抑制由PGE2诱发的C纤维活性的突触传递，它调节了排尿阈值，导致膀胱容量在阴部神经电刺激期间增加。

总之，膀胱内灌注PGE2导致乌拉坦麻醉的雌性大鼠膀胱容量降低，排尿效率增加，但膀胱收缩幅度没有变化。阴部神经电刺激逆转了PGE2诱导的膀胱容量变化，并在特定的刺激条件（10Hz、1.0T）下增加EUS EMG，故阴部神经电刺激有望成为治疗OAB的新型方法。