转人4-1BBL-B7-H3基因口腔鳞癌细胞体外诱导抗肿瘤免疫的研究

孙顺涛 杨宏宇 罗娟 余术宜 杨辉俊

口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤，以鳞状细胞癌为主。口腔癌的治疗方法较多，免疫基因治疗是重要的一种手段[1]。机体对肿瘤的免疫主要依靠T细胞免疫。T细胞活化和增殖依赖于双重信号，一是抗原呈递细胞呈递的抗原肽-主要组织相容性复合物组成的第一信号；二是共刺激信号[2-3]。T细胞只有识别这两个信号才能得到有效增殖，进而发挥其细胞免疫功能。T细胞若缺乏共刺激信号，则进入无反应状态，甚至发生凋亡[4]。CD28/B7、4-1BB/4-1BBL是激发有效抗肿瘤免疫效应所必需的重要共刺激分子[5-9]。基于此，本实验通过构建的真核表达载体pEGFP-4-1BBL-B7-H3转染人口腔鳞癌Tca8113细胞，观察4-1BBL-B7-H3的体外抗肿瘤免疫作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 口腔鳞癌Tca8113细胞由上海交通大学附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室提供，Tca8113-4-1BBL、Tca8113-B7-H3肿瘤细胞疫苗由北京大学深圳医院实验室前期构建[10-11]。小牛血清、RPMI1640培养基、G418购自美国Gibco公司（批号：1227693），IFN-γELISA试剂盒购自美国R&D公司（批号：20130013）；CCK-8购自日本Dojindo公司（批号：KM671）；兔抗人4-1BBL一抗购自美国CHEMICON公司，CD3单抗购自美国ProMab公司。Trizol、Lipofectamine 2000购自美国Ivitrogen公司。反转录试剂盒购自立陶宛Fermantas公司，PCR试剂盒购自北京博大泰克公司，人外周血淋巴细胞分离液购自深圳达科维公司。流式细胞仪表型分析仪、Thermo NanoDrop紫外分光光度计、常规试剂、超速离心机、超低温冰箱、罗氏定量PCR仪LC480等由北京大学深圳医院实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体pEGFP-4-1BBL-B7-H3的转染与鉴定 按Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行，将pEGFP-4-1BBL-B7-H3真核表达载体转染Tca8113细胞。24h后，在荧光显微镜下观察细胞生长情况和转染效率。加入 G418（400~600μg/ml）进行 4-1BBL 阳性细胞筛选，1周后用有限稀释法筛选单克隆。由于人4-1BBL-B7-H3完整的引物难以设计，故分别检测4-1BBL mRNA和B7-H3 mRNA在肿瘤组织中的表达情况。RT-PCR引物如下。4-1BBL上游引物：5′-CGGGCTCCGTTTCACTTGCG-3′；下游引物：5′-AGTCCGGCTGGGATTTCG-3′，扩增片段长 271 bp。B7-H3 上游引物：5′-CGCACGGCTCTGTCACCATCA-3′；下游引物：5′-TCAGAGGCTGCAGGGCTGTCTTG-3′，扩增片段长591bp。挑选高表达克隆并命名为Tca8113-4-1BBLB7-H3细胞用于后续实验。用Trizol从转染pEGFP-4-1BBL-B7-H3的Tca8113细胞中提取总RNA，然后用RT-PCR检测4-1BBL-B7-H3的表达，应用流式细胞仪分析细胞表型，采用RT-PCR检测转染细胞中4-1BBLB7-H3 mRNA的表达。

1.2.2 肿瘤细胞疫苗的制备 收集培养的Tca8113-4-1BBL-B7-H3 细胞，PBS 液洗 2 次，细胞数调至 1×107/ml，以20μg/ml丝裂霉素C处理后，于37℃、5%二氧化碳环境中处理1.5h，PBS液洗3次，以含10%小牛血清的RPMI1640重悬细胞，制成肿瘤细胞疫苗备用。

1.2.3 人外周血淋巴细胞的获得、培养与纯化 采用Ficoll分离的方法获得健康人的外周血单个核细胞，再经尼龙毛柱分离、纯化获得T淋巴细胞。经流式细胞仪检测，纯化后的T细胞纯度可达90%以上。

1.2.4 CCK-8法检测细胞毒性T细胞（CTL）杀伤活性将已用丝裂霉素 C（10μg/ml）处理的 Tca8113、Tca8113-4-1BBL、Tca8113-B7-H3、Tca8113-4-1BBL-B7-H3细胞株调整浓度为1×106/ml。分别与纯化后的T细胞按1∶2.5混合，分成4组。Ⅰ组：T细胞+灭活Tca8113肿瘤细胞疫苗（TCV-Tca8113）组；Ⅱ组：T细胞+灭活TCV-4-1BBL组；Ⅲ组：T细胞+灭活TCV-B7-H3组；Ⅳ组：T细胞+灭活TCV-4-1BBL-B7-H3组。4组细胞均接种于96孔板培养，100μl/孔，并设复孔。分别于培养24、48、72h弃去培养基，PBS洗2遍，分别各加入100μl无色培养基和10μl CCK-8试剂，在培养箱培育3h，于波长450nm处测定吸光度A值，检测细胞增殖情况。CTL杀伤活性按以下公式计算：CTL的杀伤活性（%）=[1-（靶细胞对照组A值-实验组A值）/靶细胞对照组A值]×100%。

1.2.5 细胞因子检测 活化后T细胞可分泌IFN-γ等细胞因子。分别于培养24、48、和72h，采用ELISA法检测4组细胞培养上清液中的IFN-γ水平。

1.3 观察指标 （1）转染细胞表型分析结果；（2）转染细胞4-1BBL-B7-H3 mRNA的表达情况；（3）比较4组细胞体外诱导CTL杀伤活性；（4）比较4组细胞培养上清液中IFN-γ水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS12.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染细胞表型分析结果 pEGFP-4-1BBL-B7-H3质粒载体转染入Tca8113细胞中，采用绿荧光标记和流式细胞仪分析细胞表型，结果显示转染的细胞能稳定高表达4-1BBL，见图1。

2.2 转染细胞4-1BBL-B7-H3 mRNA的表达情况RT-PCR产物电泳结果表明，4-1BBL扩增产物的大小约271bp，B7-H3扩增产物的大小约591 bp，与预期大小一致，见图2。这表明人4-1BBL-B7-H3质粒载体转染成功，Tca8113-4-1BBL-B7-H3细胞构建成功。

图1 转染细胞表型分析流式细胞图（a：mock/Tcca8113细胞；b:4-1BBL/Tca8113细胞）

图2 Tca8113细胞转染pEGFP-4-1BBL-B7-H3质粒后的PT-PCR产物电泳图

2.3 4组细胞体外诱导CTL杀伤活性比较 培养24、48、72h，4组细胞体外诱导CTL杀伤活性比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；且与其他3组比较，Ⅳ组细胞体外诱导CTL杀伤活性最强（均P＜0.05），见图3。

图3 4组细胞体外诱导CTL杀伤活性比较

2.4 4组细胞培养上清液中IFN-γ水平比较 培养24、48、72h，4组细胞培养上清液中IFN-γ水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与其他3组比较，Ⅰ组细胞培养上清液中IFN-γ水平最低（均P＜0.05），见图4。

图4 4组细胞培养上清液中IFN-γ水平比较

3 讨论

本实验中，笔者将构建的pEGFP-4-1BB7-H3质粒载体转染人口腔鳞癌Tca8113细胞，并获得稳定高表达，经丝裂霉素C处理后，与纯化的人外周血中的T淋巴细胞共同培养，结果显示T细胞增殖、分泌IFN-γ及抗肿瘤免疫作用明显。4-1BBL-B7-H3作为共刺激分子，能显著提高肿瘤细胞的免疫原性，协助诱导T细胞活化，激发特异性抗肿瘤免疫作用。

本实验结果显示，4-1BBL-B7-H3提供的共刺激信号能促进T细胞分泌IFN-γ。IFN-γ分泌水平也是反映T细胞活化水平的重要指标，IFN-γ可有效地增强肿瘤细胞表面MHCⅠ类和Ⅱ类抗原分子的表达，有增强抗原递呈和免疫应答的作用；促进T细胞和B细胞的分化，诱导CTL的产生；在促进激活T细胞的杀伤能力方面具有重要作用[12]。另一方面，IFN-γ亦可促进其他免疫细胞（如NK细胞）对肿瘤细胞的非特异性杀伤作用[13]。

T细胞收集纯化后，经流式细胞仪检测纯度均达90%以上，其中混有少量B细胞等单核细胞，共同培养后细胞增殖主要是以CD4+Th和CD8+Tc细胞为主。体内外研究表明，肿瘤细胞往往由于缺乏或低表达这些共刺激分子而不能活化T细胞，介导有效的抗肿瘤免疫应答[14-16]。介导共刺激信号的分子有多种，B7-H3-TLT-2共刺激信号主要在T细胞活化的前期起作用，促进T细胞增殖并维持其短期的存活；4-1BB/4-1BBL信号主要在T细胞反应后期维持T细胞的生存及在免疫记忆应答中起重要作用。肿瘤细胞及T细胞表面的一些其它相互作用分子可能对形成第一信号的三联体有一定的促进作用。

综上所述，4-1BBL-B7-H3双基因修饰的肿瘤细胞疫苗可为口腔鳞癌的治疗提供高效、特异的免疫活性细胞和具有广谱抗肿瘤活性的天然免疫细胞，这对完善肿瘤基因免疫治疗提供了一条新的途径。