阴地蕨、银粉背蕨总黄酮和总酚含量及其抗氧化能力分析

2019-01-14李懿宸张思嫔秦语真邬琦雯王嘉瑜戴锡玲

上海师范大学学报·自然科学版 2018年6期

吴帅, 李懿宸, 张思嫔, 秦语真, 邬琦雯, 王嘉瑜, 戴锡玲

(上海师范大学生命科学学院,植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234)

0 引言

蕨类植物是维管束植物中较古老原始的类群[1],因其分布广泛,资源丰富,且具有多种活性物质,一直以来都是中草药资源,其主要含有生物碱、酚类、甾类、三萜类和黄酮类等物质[2].其中,黄酮类按其化学结构可分为原花青素类、槲皮素类、柑桔生物黄酮类和绿茶多酚类,它们能抑制糖酵解过程,降低线粒体琥珀酸氧化酶活性,从而减缓肿瘤细胞的生长,起到抗癌、防癌的作用[3-4],且抗癌作用通常随黄酮抗氧化作用的提高而略增强.酚类化合物含有酚羟基或者苯烯结构,也具有广泛的生理活性,如清除自由基、抗氧化、抗紫外光辐射、抑制细菌生长、抗病毒等,在日常生活、科学研究、医疗药品等方面都有着广泛用途[5].

阴地蕨[Botrychiumternatum(Thunb) Sw.]为阴地蕨科(Botrychiaceae)阴地蕨属(Botrychium)多年生草本[6],含有阴地蕨素、槲皮素、木犀草素、3-O-α-L-鼠李糖-7-O-β-D-葡萄糖甙等多种成分.齐建红[7]研究表明,阴地蕨具有清热解毒、消炎、祛风定惊、抑制自发性肿瘤转移和实验性肿瘤转移、抑制多种病原菌的生物活性等作用,常用于治疗痔疮、支气管炎、毒蛇咬伤、风湿麻痹、跌打损伤、痄腮、乳痈、痢疾等疾病.

银粉背蕨[Aleuritopterisargentea(Gmel.) Fee]为中国蕨科(Sinopteridaceae)粉背蕨属 (Aleuritopteris)植物[6],含有山奈酚、β-谷甾醇、鼠李柠檬素、鼠尾草素、3,5,4′-三羟基-7,8-二甲氧基黄酮等多种化合物,具有镇痛、利尿、止血、抑制金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌等作用,用于治疗疮伤、骨折、脉筋损伤、活血调经、补虚止咳等疾病[8].

本研究测定了阴地蕨、银粉背蕨总黄酮和总酚含量及其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基,2,2′-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基的清除力和对Fe的还原力,分析了其抗氧化活性,为进一步开发利用阴地蕨和银粉背蕨的药用价值积累资料.

1 材料与方法

1.1 材料

本实验中的阴地蕨于2016年12月采自湖北随州,银粉背蕨于2016年10月采自河南郑州市登峰县,选取生长良好的孢子体全株.实验材料由上海师范大学生命科学学院曹建国教授鉴定,凭证标本保存在上海师范大学蕨类植物标本室.

1.2 方法

1.2.1 提取

将阴地蕨和银粉背蕨全株洗净,分离地上部分与地下部分,放在阴凉通风处晾干,随后用粉碎机分别将其打至粉末状,于4 ℃的冰箱中保存备用.阴地蕨的地上和地下部分为样品1和样品2,银粉背蕨的地上和地下部分为样品3和样品4.打开水浴锅加热至60 ℃,精确称取样品粉末2.0 g,置于锥形瓶中,分别加入25 mL体积分数为75%的乙醇溶液,60 ℃水浴2 h,超声25 min,真空泵抽滤,收集滤液于预先称重的圆底烧瓶中,再向滤渣中加入25 mL体积分数为75%乙醇溶液,60 ℃水浴2 h,超声25 min,真空泵抽滤,收集合并两次滤液于对应圆底烧瓶中[9].滤液水浴旋干,再次称重圆底烧瓶,获得提取物干重,计算提取率.

1.2.2 总黄酮含量的测定

1.2.2.1 芦丁标准曲线的制作[10]

图1 芦丁标准曲线

芦丁标准液:配制质量浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁标准液,准确称取芦丁10 mg加入体积分数为95%的乙醇中,定容至50 mL,摇匀.标准曲线的制作:取6支5 mL试管并编号,分别准确加入0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL芦丁标准液和2.5,2.0,1.5,1.0,0.5,0 mL纯净水,再向每个试管中各加入0.15 mL质量分数为5%的NaNO2溶液,将试管摇匀,静置6 min;向每个试管中加入 0.15 mL 质量分数为5% 的Al(NO3)3溶液,摇匀后静置6 min;再向每个试管中加入2.2 mL 质量分数为4%的NaOH溶液,迅速摇匀,静置12 min后,测定在510 nm波长下的吸光度(OD)值.利用Origin 软件制作芦丁浓度与吸光度之间关系的标准曲线.对吸光度与芦丁标准品做回归处理,得回归方程,如图1所示.图1中R2为线性系数,可知两者相关性良好.

1.2.2.2 总黄酮含量的测定[11]

将提取的干样品加入甲醇溶液配制成质量浓度为1 mg·mL-1的待测样品.

取1 mL样品,加入1.5 mL水、0.15 mL质量分数为5%的 NaNO2溶液,摇匀,静置6 min;加入0.15 mL质量分数为5%的Al(NO3)3溶液,摇匀,静置6 min;加入2.2 mL质量分数为4%的NaOH溶液,摇匀,静置12 min.以芦丁空白液制作的标准曲线为空白对照,在510 nm波长下测定其OD值.植物中的总黄酮质量分数

(1)

其中,X为根据回归方程算出的测试样品质量分数,m为提取物质量,M为所用植物样品质量.

1.2.3 总酚含量的测定

1.2.3.1 没食子酸标准曲线的制作[12]

图2 没食子酸标准曲线

取12支4mL试管编号01～51和0～5,试管01～51中分别加入没食子酸0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8 mL,然后再分别加入甲醇溶液2.0,1.8,1.4,1.0,0.6,0.2 mL混匀,每管取60 μL加入到对应新的试管0～5中,再加入1.54 mL水,后再加入福林试剂与水的体积比为1∶2的溶液100 μL,振荡3 min,加300 μL 质量分数为20%的Na2CO3溶液,随后在30 ℃下黑暗处理1 h,以0号试管为空白对照,测定在750 nm波长处的OD值.对OD值与没食子酸标准品质量分数作回归处理,得回归方程,如图2所示.图2中R2为线性系数,可知两者相关性良好.

1.2.3.2 总酚含量的测定

将提取的干样品加入甲醇溶液配制成质量浓度为1 mg·mL-1的待测样品.

分别取60 μL的样品加入编号6～9的4 mL试管中,加入1.54 mL水,后面加入福林试剂与水的体积比为1∶2的溶液100 μL,振荡3 min,加入300 μL质量分数为20%的Na2CO3溶液,随后在30 ℃下黑暗处理1 h,以0号试管为空白对照,测定它们在750 nm处的OD值.植物中的总酚酸质量分数CP的计算方法同式(1).

1.2.4 DPPH自由基清除能力的测定

1.2.4.1 抗坏血酸(Vc)标准曲线的制作

取6支2 mL试管编号为0～5,分别加入0,10,20,30,40,50 μL质量浓度为0.1 mg·mL-1的Vc,再分别加入500,490,480,470,460,450 μL纯水,最后各加入500 μL 的DPPH溶液,摇匀,静置30 min.以0号试管为空白对照,测定517 nm波长下的OD值.

1.2.4.2 样品测定

将提取的干样品分别加入无水乙醇溶液配制成质量浓度为1 mg·mL-1的待测样品.

1)样品1、2:取7支2 mL的试管编号为0～6,分别加入0,50,100,150,200,250,300 μL样品溶液,再加入500,450,400,350,300,250,200 μL无水乙醇溶液,再各加入DPPH溶液500 μL,摇匀,静置30 min.以0号试管为空白对照,测定517 nm波长下的OD值.

2)样品3、4:取6支2 mL的试管编号为0～5,分别加入0,10,20,30,40,50 μL样品溶液,再加入500,490,480,470,460,450 μL水,再各加入DPPH溶液500 μL,摇匀,静置30 min.以0号试管为空白对照,测定517 nm波长下的OD值.DPPH自由基活性清除率

(2)

其中,A0为无样品溶液的OD值,A1为有样品溶液的OD值.

作图并求出样品对DPPH自由基的半清除能力IC50值,即DPPH自由基清除率为50%时的总黄酮及总酚含量,进行比较.

1.2.5 ABTS自由基清除能力的测定

1.2.5.1 ABTS溶液的制备

ABTS储备液的制备:将78 mg ABTS粉末和13.2 mg过硫酸钾溶于20 mL超纯水中,搅拌溶解,4 ℃下贮存,待16 h溶液稳定后使用.

ABTS工作液:取2 mL ABTS储备液加入150 mL无水乙醇,使其在734 nm波长下的OD值为0.700±0.010.

1.2.5.2 样品测定

将提取的干样品分别加入无水乙醇溶液配制成质量浓度为1 mg·mL-1的待测样品.

1)样品1、2:取9支5 mL试管编号为0～8,分别加入0,20,60,100,140,180,220,300,400 μL样品,用无水乙醇定容至1 mL,再加入3 mL ABTS工作液静置6 min,测定734 nm波长下的OD值.

2)样品3、4:取7支5 mL试管编号为0～6,分别加入0,30,60,90,120,150,180 μL样品,用无水乙醇定容至1 mL,再加入3 mL ABTS工作液静置6 min,测定734 nm波长下的OD值.

3)Vc作为阳性对照:取6支5 mL试管编号为0～5,分别加入0,10,20,40,60,80 μL样品,用水定容至1 mL,再加入3 mL ABTS工作液静置6 min,测定734 nm波长下的OD值.

ABTS自由基清除率CABTS计算方法同式(2).作图并求出IC50值,进行比较.

1.2.6 Fe还原力的测定

将提取的干样品分别加入无水乙醇溶液配制成质量浓度为1 mg·mL-1的待测样品.

分别取5支5 mL试管编号为1～5,加入100,300,500,700,900 μL样品,加入900,700,500,300,100 μL水,加入pH值为6的磷酸缓冲液各2.5 mL,加入2.5 mL 质量分数为1%的K3[Fe(CN)6]溶液,在50 ℃下水浴20 min,加2.5 mL三氯乙酸(TCA),以3000 r·min-1的转速离心10 min.

Fe还原力

(3)

其中,A1为2.5 mL上清液加2.5 mL水加0.5 mL FeCl3的混合液在700 nm波长处测定的OD值,A2为2.5 mL上清液加3 mL水的混合液在700 nm波长处测定的OD值.

作图并求出样品对Fe的还原力为15%时总黄酮及总酚含量,进行比较.

1.3 数据采集及分析

本实验采用DHG-9140A Infinite M200 PRO酶标仪(TECAN公司)测定溶液的OD值,实验数据使用Origin软件制作出标准曲线,利用Excel软件作图.每个实验均重复3次,数据取平均值,以减少误差.

2 结果与分析

2.1 阴地蕨和银粉背蕨乙醇提取物的提取率

材料的乙醇提取率可以用来分析蕨类植物中物质的积累量,还可以分析提取物的量与其生物活性是否存在相关关系[12].本研究中乙醇提取率是指样品体积分数为75%的乙醇中得到的提取物与材料粉末的比值.阴地蕨和银粉背蕨不同部位乙醇提取物的提取率存在差异,地上部分提取物的含量均明显高于其地下部分,如表1所示.

表1 样品乙醇提取率 %

2.2 两种蕨类植物总黄酮含量分析

两种蕨类植物中都含有黄酮化合物.银粉背蕨地上部分总黄酮质量分数为41.3 mg·g-1,其地下部分总黄酮质量分数为6.3 mg·g-1;阴地蕨地上部分总黄酮质量分数为9.7 mg·g-1,其地下部分总黄酮质量分数为4.2 mg·g-1(图3).从图3中可以看出:同种植物地上部分的总黄酮含量明显大于地下部分的;两种间总黄酮含量存在一定差异;总黄酮含量由高到低依次为银粉背蕨(地上)、阴地蕨(地上)、银粉背蕨(地下)、阴地蕨(地下),银粉背蕨(地上)的总黄酮含量(最高)大约是阴地蕨(地下)的(最低)10倍.

2.3 两种蕨类植物总酚含量分析

图3 提取物中总黄酮与总酚的含量比较

两种蕨类植物都含有酚酸物质(图3).银粉背蕨地上部分总酚质量分数为16.4 mg·g-1,银粉背蕨地下部分总酚质量分数为3.9 mg·g-1;阴地蕨地上部分总酚质量分数为7.1 mg·g-1,阴地蕨地下部分总酚质量分数为5.4 mg·g-1.两种蕨类植物的总酚含量间存在一定差异,由高到低依次为:银粉背蕨(地上)、阴地蕨(地上)、阴地蕨(地下)、银粉背蕨(地下),同种植物的地上部分的总酚含量大于地下部分的.

2.4 两种蕨类植物DPPH自由基清除率分析

图4 提取物DPPH自由基清除率与总黄酮质量浓度的关系

DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基,实验中样品将DPPH自由基清除,表明样品的总黄酮及总酚质量浓度达到能降低羟基自由基、烷基自由基、过氧化自由基的有效浓度,或者能打断脂质过氧化链的有效浓度[13].银粉背蕨和阴地蕨都具有一定的DPPH清除能力,如图4所示.由图4可知,DPPH自由基清除率能力最强的是银粉背蕨地上部分,最小的是阴地蕨地下部分.利用软件OriginPro计算不同样品的IC50值,由于阴地蕨地下部分对DPPH自由基清除效果太差,未能算出其IC50值[14].

图5 各提取物对DPPH自由基清除能力的IC50值

由图4还可知,银粉背蕨地下部分在较低的总黄酮浓度下即可达到较高的DPPH自由基清除率,当总黄酮质量浓度为50 μg·mL-1时,其清除率已经超过70%,而在小于40 μg·mL-1时清除率随样品总黄酮含量的增加呈线性增长;银粉背蕨地上部分的DPPH自由基清除率也较高,与地下部分的差异不明显,因此在应用时不必特意区分地上与地下部分.阴地蕨中总黄酮浓度增加与DPPH自由基活性清除率增大呈线性趋势,但其清除率较低,地上部分与地下部分差异明显.地下部分的DPPH清除效果差,当总黄酮质量浓度为300 μg·mL-1时DPPH自由基清除率只有20%,在应用时应区分其地上部分与其地下部分,以达到更高的使用效率.图5为各提取物对DPPH自由基清除能力的IC50值.由图5可知,银粉背蕨对DPPH自由基清除率明显高于阴地蕨的.比较图4、5可知:DPPH自由基的清除能力由高到低依次为银粉背蕨(地上)、银粉背蕨(地下)、阴地蕨(地上)、阴地蕨(地下);在一定范围内,阴地蕨和银粉背蕨的DPPH自由基清除率随总黄酮和总酚浓度的增加而逐渐增加.

2.5 两种蕨类植物ABTS自由基清除率

在ABTS自由基清除体系中,ABTS+离子基团被氧化后生成相对稳定的ABTS水溶性自由基,溶液呈蓝绿色,抗氧化剂与ABTS+离子基团反应后使溶液颜色变浅,特征峰值降低,因此溶液褪色越明显则表明所检测物质的总抗氧化能力越强[15].图6为各提取物ABTS自由基清除率随总黄酮及总酚质量浓度的变化.由图6可知,阴地蕨和银粉背蕨都有一定的ABTS自由基清除能力,且地下部分较地上部分清除效果更好,但差异不明显.因此,在应用时不用特意区分地上部分与地下部分.图7为各提取物对ABTS自由基清除能力的IC50值.由图6和IC50值(图7)的数据可以看出,银粉背蕨地下部分ABTS自由基清除力最大,阴地蕨地上部分ABTS自由基清除力相对最小,银粉背蕨对ABTS自由基清除力明显高于阴地蕨.清除DPPH自由基的能力由高到低依次为:银粉背蕨(地下)、银粉背蕨(地上)、阴地蕨(地下)、阴地蕨(地上),且随总黄酮和总酚浓度的增加而增加.

图6 各提取物ABTS自由基清除率随总黄酮及总酚质量浓度的变化

图7 各提取物对ABTS自由基清除能力的IC50值

2.6 两种蕨类植物Fe还原力的测定

在Fe还原力测定过程中,样品中的还原物质将赤血盐[K3Fe(CN)6]还原成黄血盐[K4Fe(CN)6],黄血盐再与 Fe3+作用,生成普鲁士蓝,从而使样品溶液变色,在 700 nm波长处测定OD值,可以检测普鲁士蓝的生成量以评价试样的还原力[16].图8为各提取物铁还原力随总黄酮及总酚质量浓度的变化关系.由图8可知,测定的阴地蕨和银粉背蕨都存在一定的Fe还原力,其种间差异十分明显,银粉背蕨的效果远强于阴地蕨.银粉背蕨地上部分与地下部分效果良好,与样品含量呈明显正相关的线性关系.但银粉背蕨地上效果明显优于地下部分,在应用时可考虑区分对待.而阴地蕨的抗氧化活性较差,虽然随样品含量增加,清除率有一定的增长,但增长幅度较小,地上部分与地下部分差异不明显.由图9可知,Fe还原力达到15%时所需样品的量各有不同,其中银粉背蕨地上部分所需样品的量最少,为84.9 μL,阴地蕨地下部分最多,需要881.6 μL.Fe还原力由高到低依次为银粉背蕨(地上)、银粉背蕨(地下)、阴地蕨(地上)、阴地蕨(地下).从图8和9可知,在一定范围内随阴地蕨和银粉背蕨总黄酮和总酚浓度的增加,Fe还原力逐渐增大.

图8 各提取物铁还原力随总黄酮及总酚质量浓度的变化关系

图9 Fe还原力为15%时样品中总黄酮及总酚质量浓度

3 讨论

3.1 蕨类植物总黄酮含量及其影响因素

黄酮类化合物广泛存在于蕨类植物中,不同的蕨类植物中黄酮含量和种类不尽相同.乌毛蕨科、鳞毛蕨科、水龙骨科、叉蕨科植物中黄酮含量相对丰富,而凤尾蕨科、铁角蕨科、瘤足蕨科植物中黄酮含量相对较低[15].蔡建秀等[17]研究发现,鳞始蕨科乌蕨(Stenolomachusans)地上部分中的黄酮质量分数最高,达34.24%.本研究中银粉背蕨和阴地蕨种间总黄酮质量分数为0.42%～4.12%,存在一定差异.不同蕨类植物总黄酮含量不同的原因可能有:基因组不同导致表达产物不同,生长环境和对环境的适应不同造成的次生代谢产物不同[18].

田兰兰等[19]研究表明:蕨类植物不同部位中总黄酮含量存在差异.里白科芒萁不同部位中黄酮含量具有明显差异,其中根部的黄酮质量分数达28.06%,而干燥老叶中的黄酮质量分数为22.05%,黄酮在嫩茎中含量最低.银粉背蕨和阴地蕨地上部分的总黄酮含量均明显大于地下部分的,同种植物不同部位的总黄酮含量不同的原因可能有:1) 植物细胞在分裂分化过程中,基因选择性表达不同,各器官在生长发育过程中功能不同,具有不同的生理代谢反应,从而使不同部位代谢物含量存在明显差异[18];2) 由于植物呼吸和光合作用水平不一,在光敏反应、能量转运、形态形成过程中,在植物生长激素、生长调节剂的影响下,同一植株的不同部位总黄酮含量不同;3) 从生理活性角度讲,黄酮类化合物具有消炎、抗病毒、防止过敏等作用,银粉背蕨和阴地蕨植株的地上部分长期暴露于外界环境,植物易遭受虫害以及食草动物伤害,而地下部分的生长环境单一且根系不发达,在植物提高自身保护能力和生存能力、协调环境关系中起重要作用,次生代谢产物产生和变化比初生代谢产物与环境有着更强的相关性[20].本研究结果显示:银粉背蕨和阴地蕨不同部位总黄酮含量不同的现象,与机体不同部位的组织特异性,以及针对环境不同而产生的防御、信号传导、适应调节和生长发育等因素息息相关[21].

3.2 蕨类植物总酚含量及其影响因素

研究表明,鳞毛蕨科植物的总酚质量分数为5%～20%,扇叶铁线蕨的总酚质量分数为7.8%～13.2%,乌蕨的总酚质量分数为1.6%～3.6%,且它们不同部位的总酚含量均有所不同[12,22-23].本研究测得银粉背蕨和阴地蕨总酚的质量分数为0.39%～1.64%,银粉背蕨地上和地下部分的总酚质量分数分别为16.4 mg·g-1和3.9 mg·g-1,阴地蕨的地上和地下部分的总酚质量分数分别为7.1 mg·g-1和5.4 mg·g-1.由此可见不同蕨类植物及其不同部位中总酚含量不同,具有组织特异性,推测其原因与总黄酮含量差异原因相似.

3.3 蕨类植物总黄酮和总酚含量与抗氧化活性之间的相关性

蕨类植物总黄酮和总酚含量与ABTS、DPPH自由基清除能力、Fe还原力及总抗氧化能力之间具有一定的相关性.本研究中在一定范围内,随着两种蕨类中总黄酮和总酚含量的增加,它们的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、Fe还原力等抗氧化能力都呈上升趋势,即提取物抗氧化活性与总黄酮和总酚含量存在浓度依赖,但不同蕨类植物、不同部位之间效果具有明显差异.可能原因有:1) 由于银粉背蕨和阴地蕨的遗传因素、生态环境、生存条件等不同,其体内黄酮和酚酸种类和结构存在差异;2) 本实验使用的是粗提取物,除总黄酮和总酚外,还有其他抗氧化物质,如多糖的存在.