厌氧发酵反应器的启动运行及活性污泥的优势菌群分析

王靖媛, 秦 智, 尹 梦

(上海师范大学 生命科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234)

0 引 言

两相厌氧处理系统中,产酸相反应器的运行不仅能利用活性污泥中微生物的代谢活动处理高浓度有机废水,将大分子有机物降解为乙醇、乙酸和丁酸等小分子物质,还可在分解废水污染物的同时使反应器产生氢气.氢气作为21世纪最具有发展潜力的清洁能源,对改善以石化燃料为主的能源结构,实现社会环境协调发展起着重要作用.两相厌氧生物处理系统中产酸相效能的高低直接影响着整个工艺系统的处理能力和运行的成败.

厌氧发酵技术在许多发达国家应用广泛[1].杨景亮等[2]利用两相厌氧工艺处理含高浓度硫酸盐的废水,获得较好的效果.李建政等[3]对两相厌氧反应器中产酸相反应器的快速启动以及污泥驯化进行研究,结果表明:在接种污泥质量浓度不少于6.5 g·L-1,并控制进水化学需氧量(COD)、水力停留时间(HRT)和pH值的情况下,可在20 d内完成产酸相的快速启动,并可在45 d左右实现对乙醇型发酵菌群的驯化.班巧英等[4]利用厌氧折流板反应器(ABR)驯化污泥,并考察系统中产甲烷菌群的空间分布特征,证实了ABR中产甲烷菌的多样性明显高于产氢/产乙酸菌,当反应器受到冲击时,产氢/产乙酸作用更容易成为限速步骤.胡小兵等[5]利用序列间歇式活性污泥法反应器(SBR)培养驯化阶段的活性污泥,证实活性污泥培养驯化是微型动物群落物种多样性水平增高后趋于稳定的过程.于凤庆等[6]在研究膜生物反应器(MBR)启动运行阶段的活性污泥驯化过程中发现,活性污泥中微生物群落演替明显,并且随反应器内不同时期及环境的变化逐渐演变成适应MBR工艺的群落结构.Chen等[7]利用连续流搅拌槽式厌氧发酵反应器(CSTR)对活性污泥进行驯化培养,在启动运行阶段控制HRT,采用半连续进料,当出水pH值降到5.18时,控制pH值在6.70左右,同时将半连续进料改为连续进料.经过60 d驯化,将活性污泥驯化成理想状态,并从中筛选到产氢菌种.昌盛等[8]利用厌氧接触式发酵制氢反应器(ACR)驯化活性污泥,并通过调控反应器pH值考察反应器中产酸发酵类型和产氢性能,发现在不同pH值的控制下,活性污泥中会形成不同的顶级微生物群落结构,使得系统呈现出不同的发酵类型和产氢性能.

本文作者以糖蜜废水为底物,在CSTR中,进行反应器的启动运行和活性污泥的驯化,并对反应器运行前后活性污泥的优势菌群进行分析,以期为厌氧发酵反应器顺利完成启动运行,并实现产氢活性污泥的驯化提供控制参数的参考数据,并为在有机废水处理的同时制取氢气提供研究基础.

1 实验装置和方法

1.1 实验装置

图1 厌氧发酵反应器装置.1 蠕动泵;2厌氧发酵反应器;3搅拌桨;4温控仪;5湿式气体流量计

CSTR由有机玻璃制成.反应器的有效容积为5.9 L,整体反应装置采用密闭设计,反应器搅拌装置通过轴封保证反应器内部的厌氧环境.配制的甘蔗糖蜜废水通过计量泵连续泵入反应器中,厌氧发酵反应器产生的气体从排气管经过气体流量计排出.反应器内设有搅拌装置使活性污泥与底物充分完全接触和混合.反应器通过水浴加热装置将运行温度控制在(35±1)℃,厌氧发酵反应器的流程图如图1所示.

1.2 实验底物及污泥的培养

实验采用的底物是甘蔗糖蜜废水,原料为甘蔗制糖生产过程中经压榨和浓缩等工序制糖后的剩余废液,通过稀释形成一定浓度的甘蔗糖蜜废水.向糖蜜废水中投加适量NH4Cl和K2HPO4,使反应器进水中化学需氧量(COD)与氮、磷的质量比控制在:m(COD)∶m(N)∶m(P)=1000∶5∶1.反应器内投加的活性污泥是取自生活污水处理厂初沉池的底泥,经过曝气培养后接种于厌氧发酵反应器装置中.

1.3 反应器运行的工程参数控制

反应器的运行主要分为3个阶段,分别为反应器启动运行初期、中期和后期.第一阶段从活性污泥投加到反应器中启动反应器连续运行开始,至反应器运行第29 d.在此阶段进水COD控制在3200 mg·L-1左右,运行共29 d.第二阶段从反应器运行第30 d至反应器运行第47 d,在此阶段进水COD提升到4200 mg·L-1左右,共运行18 d.第三阶段从反应器运行第48 d至第58 d,进水COD进一步提升至5500 mg·L-1左右,共运行11 d.反应器启动运行阶段的HRT通过调节反应器的进水流量控制.反应器中投加的活性污泥的混合液悬浮物固体质量浓度(MLSS)为18.4 g·L-1.搅拌桨的转速控制在130 r·min-1.

1.4 测定方法

COD采用重铬酸钾法进行测定[9].使用pH计进行pH值的测定.液相发酵产物的质量浓度采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用进行测定.采用美国国家环保局方法测定乙醇的质量浓度[10].乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的质量浓度采用气相色谱法[11]进行测定.活性污泥沉降体积测定方法参考文献[12].采用Illumina MiSeq测序平台进行活性污泥优势菌群分析[13-14].高通量测序主要针对细菌的V3—V4区域进行扩增,采用E.Z.N.ATMMag Bind Soil DNA Kit试剂盒进行厌氧活性污泥的总DNA提取.扩增采用的聚合酶链式反应(PCR)引物是Miseq测序平台的通用引物.341F引物序列为:5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′.805R引物序列为:5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′.PCR的反应体系为:2×Taq master Mix 15μL,Bar-PCR primer F(10 μmol·L-1) 1μL,Primer R(10 μmol·L-1) 1 μL,Genomic DNA 10～20 mg 加蒸馏水至30 μL.第二轮PCR扩增体系为:2×Taq master Mix 15 μL,Primer F(10 μmol·L-1) 1 μL,Primer R(10 μmol·L-1) 1 μL,PCR products 20 μL.PCR扩增条件为:预变性94 ℃,3 min后执行94 ℃,30 s;45 ℃,20 s;65 ℃,30 s,共5个循环,然后执行94 ℃,20 s;72 ℃,30 s,共20个循环,最后退火72 ℃,5 min.PCR扩增结束后进行琼脂糖电泳检测,观察电泳结果,进行DNA纯化回收.再利用Qubit 3.0 DNA试剂盒对回收的DNA进行精确定量.测序委托上海生工生物工程股份有限公司完成.测序结果与美国国立生物技术信息中心(NCBI)的BlastX进行序列比对.

2 结果与分析

2.1 反应器启动运行阶段进出水COD的变化规律

图2 反应器运行过程中进、出水COD浓度及COD去除率的变化情况

COD是反映废水污染程度的重要指标之一,在糖蜜废水的厌氧发酵的启动运行阶段,采用较高的进水COD浓度,既可发挥厌氧发酵过程有效处理高浓度有机废水的优势,也可加速厌氧反应器的启动,使其快速完成启动过程,进入稳定运行阶段.厌氧发酵反应器启动运行阶段的进、出水COD以及COD去除率的测定结果如图2所示.由图2可知,反应器在运行过程中对高浓度有机废水的COD具有一定的降解作用.反应器启动运行初期进水COD控制在3200 mg·L-1左右,此阶段COD去除率较低,在3.6%～13.4%之间浮动,这可能与反应器处于启动运行初期,活性污泥没有经过长期驯化而未能达到理想的生理状态有关.反应器启动运行中期进水COD维持在4200 mg·L-1左右,反应器的COD去除率有明显的提高,此阶段的出水COD基本维持在3500 mg·L-1,平均COD去除率为19%左右.反应器启动运行后期进水COD为5200 mg·L-1左右.整个阶段的COD去除率维持在稳定水平,出水COD为4300 mg·L-1左右,COD的平均去除率达到约20%,其中COD的去除率最高值出现在运行第44 d,为33.7%,此时的进水COD是5504 mg·L-1,出水COD是3651 mg·L-1.进水COD为4200 mg·L-1左右与进水COD为5200 mg·L-1左右时的COD去除率无明显差异.研究结果表明:厌氧发酵反应器在启动运行过程中具有一定的COD去除能力,在反应器的进水COD达到较高浓度时,仍具有较为稳定的COD去除率.

2.2 水力停留时间对COD去除率的影响

HRT是指待处理污水在反应器内的平均停留时间,即污水与生物反应器内微生物作用的平均反应时间.对HRT的控制是影响反应器运行的指标之一.在厌氧发酵反应器运行过程中,控制反应器的HRT,观察COD去除率、出水悬浮物以及活性污泥生物量的变化情况.结果如图3,表1所示.

由图3和表1可知,当HRT控制在12 h时,COD去除率最高,是最佳HRT.当HRT控制在6 h时,测得出水悬浮物平均质量浓度为1.897 g·L-1,生物量(质量浓度)由12.7 g·L-1减少到7.0 g·L-1,大量污泥随出水被冲出.当HRT控制在8 h时,出水悬浮物平均质量浓度为1.224 g·L-1,可观察到出水中有少量污泥,此时被冲出反应器的污泥量虽然减少,但活性污泥与底物作用时间不够充分,因此COD的去除率仍然不高.当HRT控制在10 h时,出水悬浮物平均质量浓度为0.467 g·L-1,出水较清,生物量由8.0 g·L-1增加到10.8 g·L-1,并且此阶段的COD平均去除率为19.5%,有所提高.当HRT控制在12h时,出水悬浮物平均质量浓度为0.479 g·L-1,出水较清,COD平均去除率为22.8%,进一步提高,生物量也进一步提高到12.6 g·L-1,因此最佳HRT为12 h.HRT过短会导致活性污泥大量冲出,污泥中的微生物大量损失,并且活性污泥中的微生物与底物作用时间不够充分.HRT适当,则活性污泥中的微生物与底物作用时间充分,并且活性污泥不易被冲出,COD的去除率维持较高水平.控制好HRT能够为反应器的良好运行提供保障.

图3 HRT对COD去除率的影响

表1 活性污泥生物量随HRT的变化关系

2.3 液相发酵产物

液相发酵产物是判断活性污泥运行状况的重要指标之一,通过对液相发酵产物含量的分析,可以考察厌氧发酵反应器启动运行阶段微生物菌群的代谢情况,分析反应器中活性污泥的发酵类型.选取启动运行初期和启动运行后期的出水样品,进行发酵液发酵产物的测定.测定结果详见表2.

表2 反应器启动运行初期及后期的液相发酵产物的质量浓度 mg·L-1

由表2可知,厌氧反应器启动运行初期,液相发酵产物中乙醇质量浓度较低,为28.2 mg·L-1,乙酸的质量浓度最高为612.0 mg·L-1,液相发酵产物总质量浓度为1027.2 mg·L-1.在启动运行初期的发酵产物中,乙酸占有绝对优势,乙酸的质量占发酵产物总质量的59.6%.在反应器启动运行后期,乙醇、丁酸和正戊酸的含量均有所增加,液相发酵产物的总质量浓度也增加至1298 mg·L-1.反应器启动运行后期的发酵产物中,乙酸和丁酸质量占发酵产物总质量的73.1%,属于丁酸型发酵.对比反应器运行同时间段的COD运行数据发现:反应器启动运行第5 d,进水COD为3252 mg·L-1;运行至第46 d时,进水COD提高为5486 mg·L-1,这可能是反应器运行后期发酵产物总量上升的主要原因.另外,综合反应器启动运行阶段的进、出水COD和发酵产物分析可知,虽然在厌氧发酵反应器的运行过程中,整体COD去除率不高,在反应器启动运行后期COD去除率为16.7%,但在连续运行的厌氧发酵过程中,活性污泥可将糖蜜废水中的大分子物质降解为乙酸、丙酸、丁酸等小分子物质,厌氧发酵反应器作为两相厌氧废水处理工艺中的产酸相,可为后续的废水处理单元——产甲烷相提供降解后的小分子物质,有利于后续废水处理单元达到较高的COD去除效果.

2.4 pH值的变化规律

图4 pH值的变化情况

pH值是影响厌氧发酵反应系统中活性污泥的代谢产物和微生物群落组成的重要工程运行参数[15].在厌氧发酵反应器运行过程中,较高的有机负荷易造成有机酸的大量积累,引起pH值的大幅度下降,影响反应器的发酵性能,这一现象就是厌氧发酵过程中的“酸化”[16-17].CSTR运行过程中进、出水pH值的变化规律如图4所示.

由图4可知,在启动阶段,进水pH值维持在6.0～6.5,出水pH值在启动运行初期出现了剧烈的下降过程.运行第1d,反应器的出水pH值为5.4,运行至第3d时,反应器的出水pH值迅速下降到4.9,此后出水pH值基本维持在4.7～4.9.出水pH值的迅速下降主要是由于反应器中活性污泥微生物厌氧发酵产生较多的酸性发酵产物,酸性发酵产物的大量累积导致pH值的下降.在反应器运行的中期和后期,进水COD逐渐提升到5000 mg·L-1以上,在此过程中,出水pH值一直稳定在4.7～4.9之间,说明反应器内活性污泥菌群在提高容积负荷的条件下仍然具有较高的pH值缓冲能力.

2.5 活性污泥沉降体积分析

实验采用的反应器为CSTR,在反应器启动运行期间,始终保持连续进水和连续出水,而且反应器的出水口位于反应装置顶部,因此反应器内的活性污泥只有保持良好的沉降性能才能避免其随着出水的连续流动而流失.活性污泥沉降体积是判断厌氧发酵反应器内部活性污泥运行状况的重要参数之一.在反应器启动运行的初期、中期和后期,分别取活性污泥进行污泥沉降体积测试,分析反应器中活性污泥的沉降性能,研究结果如图5所示.由图5(a)可知,在反应器启动运行初期,活性污泥的沉降速度较慢,沉降30 min时,沉降污泥的体积分数为66%;经过长达1 h的沉降后,沉降污泥的体积分数为55%,沉降性能较差.观察发现,启动第1 d投入反应器中的活性污泥呈现黑色,肉眼无法观察到片状絮凝污泥.在反应器运行到第45d时,污泥沉降体积结果如图5(b)所示,在沉降30 min时沉降活性污泥的体积分数为46%,沉降1h后的沉降体积分数为36%,此时期活性污泥的沉降速度逐渐提高,沉降性能有所改善.当反应器运行到第57 d,污泥沉降体积结果如图5(c)所示,沉降30 min时沉降活性污泥的体积分数为37%,沉降1 h时沉降污泥的体积分数为28%.反应器启动运行后期,污泥沉降速度较快,此时反应器中的活性污泥具有良好的沉降性能.观察发现,此时的活性污泥呈现黄棕色,形成明显的片状絮凝污泥.由此可知,活性污泥在反应器内经过较长时间的驯化后,具备了较好的沉降性能.

图5 反应器启动运行(a) 初期,(b) 中期,(c) 后期污泥沉降体积变化

2.6 启动初期和启动后期活性污泥的优势菌群对比分析

在反应器启动运行的过程中,选取反应器启动运行初期(第3 d)和启动运行后期(第59 d)的活性污泥进行了驯化前后的活性污泥优势菌群对比分析.表3和表4分别为反应器启动运行初、后期活性污泥中的优势菌群组成.由表3,4可知,活性污泥在投加到反应器的初始阶段,活性污泥中的微生物种类较丰富,其中Spartobacteria微生物的总体数量较高,在活性污泥微生物总量中的物种丰度比例为26.10%,其他微生物的占比均不高.产乙醇杆菌属(Ethanoligenens)在启动运行初期仅占活性污泥微生物总量的1.43%,梭菌属(ClostridiumⅣ)占活性污泥微生物总量的4.69%.经过60 d左右的反应器运行和活性污泥驯化,在反应器启动运行后期,活性污泥的微生物种类发生巨大变化,优势菌群分别为产乙醇杆菌属(Ethanoligenens)、巨型球菌属和梭菌属.其中,产乙醇杆菌属的菌数占活性污泥微生物总量的24.16%,巨型球菌属(Megasphaera)为21.44%,梭菌属(ClostridiumⅣ)为15.52%.研究结果表明:经过驯化后的活性污泥中与产氢功能相关的菌种属占活性污泥中微生物总量的40%以上[18-19].其中,Clostridiums.s和ClostridiumIV等梭状芽孢杆菌属具有水解产酸代谢功能,同时还具有产芽孢和耐酸的特性[20].Spartobacteriagenera_incertae_sedis属的水平分类未定,相关背景资料较少[21].研究结果表明:在反应器启动运行期间,通过控制进水COD和进、出水pH值,可实现活性污泥菌群的定向驯化,使之形成与产氢功能密切相关的优势菌群.

表3 反应器启动运行初期活性污泥的优势菌群对比

表4 反应器启动运行后期活性污泥的优势菌群对比

3 结 论

CSTR在温度为35 ℃,进水COD从3200 mg·L-1逐渐增加至5500 mg·L-1的条件下启动运行,经过60 d左右可较好地完成反应器的启动过程,形成较为稳定的运行状态,实现活性污泥的定向驯化.

在反应器运行较为稳定的启动运行后期,反应器出水的液相发酵产物总量为1298 mg·L-1,其中乙酸和丁酸质量占发酵产物总质量的73.1%,形成丁酸型发酵的主要发酵产物.分析认为,反应器的pH值是影响反应器发酵类型的重要因素,启动运行阶段的发酵产物形成丁酸型发酵与反应器出水pH值基本稳定在4.7～4.9有关.大量研究表明,当CSTR运行阶段的出水pH值在4.0～4.5时,反应器的液相发酵产物通常以乙醇和乙酸为主,形成乙醇型发酵;当反应器出水pH值为4.5～5.0时,反应器基本形成丁酸型发酵,产生以乙酸和丁酸为主的发酵产物;当反应器出水pH值为5.0以上时,反应器更容易形成混合酸发酵,此时乙醇、乙酸、丙酸、丁酸等多种发酵产物同时存在,且没有发酵产物占有绝对优势[22-24].综上所述,在反应器的运行中通过控制进水COD的浓度,进而使反应器出水pH值控制在一定范围内,可有效实现反应器启动阶段的发酵类型控制.

反应器启动运行过程中经过驯化的活性污泥,形成以产乙醇杆菌属(Ethanoligenes)、巨型球菌属(Megasphaera)和Ⅳ型梭菌(ClostridiumⅣ)为主的优势菌群.其中产乙醇杆菌和Ⅳ型梭菌均为产氢能力较高的产氢菌株,在每摩尔葡萄糖中的产生氢气的最大物质的量分别为2.81 mol和1.57 mol[25-26],因此在厌氧发酵反应器启动运行期间,通过COD和pH值的参数控制,可实现活性污泥菌群的定向驯化,形成以产氢为主的功能性菌群,产氢功能性菌群占活性污泥微生物总量的40%以上.