畜禽球虫生物学与球虫病防治研究——记上海兽医研究所四十年研究回顾

黄 兵，韩红玉，董 辉，赵其平，朱顺海

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241）

0 前言

球虫（Coccidia）隶属于顶复器门（Apicomplexa Levine，1970）、孢子虫纲（Sporozoasida Leuckart，1879）、真球虫目（Eucoccidiorida Léger and Duboscq，1910）的原虫，广义的球虫范围包括真球虫目中隐球虫亚目（Adeleorina L é ger，1911）和艾美耳球虫亚目（Eimeriorina L é ger，1911）所含的种类近2000种，其中艾美耳球虫亚目的种类约1500种，隶属于10科37属；狭义的球虫范围主要指艾美耳球虫亚目中艾美耳科（Eimeriidae Minchin，1903）所含的种类，约有1300多种，隶属于16属，其中艾美耳属（EimeriaSchneider，1875）的球虫超过1000种[1]。据统计，全世界已在无脊椎动物和脊椎动物发现艾美耳科球虫2599种，其中在哺乳类1028种、鸟类734种、爬行类456种、两栖类53种、鱼类314种、无脊椎类14种[2]。球虫病是危害动物健康的一类重要原虫病，特别对养禽业的危害巨大，每年可导致上亿元的经济损失。几十年来我国在球虫与球虫病防治研究方面做了大量工作，仅从中国知网以“球虫”作为主题检出的各类文献达13 000多条。

中国农业科学院上海兽医研究所（原：中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所、中国农业科学院上海家畜血吸虫病研究所）是我国从事球虫与球虫病防治研究的主要单位之一，开发的国家二类新兽药——地克珠利曾获得国家科技进步三等奖，研制的抗球虫病DLV三价疫苗是国内首个获得国家新兽药证书的球虫疫苗，起草制订了第1个球虫病诊断技术国家标准，在国内外发表球虫相关研究报告300多篇。回顾过去近40年的工作，主要在以下几个方面取得重要进展。

1 流行病学

球虫在我国畜禽中分布十分广泛，种类较多。史天卫等[3]（1989）对上海地区鸡球虫种类进行了初步调查，记录了鸡的6种艾美耳球虫。据文献记载[4-6]，在我国的马、骆驼、牛、羊、猪、犬、猫、兔、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑等已检出球虫145种（表1），其中艾美耳球虫122种，等孢球虫（IsosporaSchneider, 1881）13种，泰泽球虫（TyzzeriaAllen，1936）6种，温扬球虫（WenyonellaHoare，1933）4种；球虫分布达到15个及以上省市自治区的有41种，包括鸡球虫9种、牛球虫5种、兔球虫11种、羊球虫9种、猪球虫5种、鸭球虫2种（表2）；还鉴定命名了11个新种，包括艾美耳球虫10种和等孢球虫1种（表3）。经调查，1）上海鸡场的球虫感染率通常在45%以上，1/3鸡场感染率达90%～100%；球虫阳性鸡的感染强度（每克粪便卵囊数，OPG）为400～63 800个，平均OPG为32 114个，超过50%鸡场的OPG在48 000个以上；鉴定出6种球虫，即柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）、毒害艾美耳球虫（E. necatrix）、巨型艾美耳球虫（E. maxima）、堆型艾美耳球虫（E. acervulina）、变位艾美耳球虫（E. mivati）以及缓艾美耳球虫（E. mitis）[7]。2）上海鸭场的球虫感染率为61%，3月龄以内鸭的感染率为100%；球虫阳性鸭的OPG为300～112 200，平均OPG为4 841；鉴定出10种球虫，其中艾美耳属6种、温扬属3种、等孢属1种[8,9]。3）上海部分鸽场的球虫感染率为52.8%，球虫阳性鸽的OPG为300～512 400，平均OPG为50 159个，肉鸽的感染率（55.2%）和平均OPG（52 110个）均高于信鸽（40.9%和37 583个）；鉴定出5种球虫，即拉氏艾美耳球虫（E. labbeana）、鸽艾美耳球虫（E.columbae）、原鸽艾美耳球虫（E. columbarum）、杜氏艾美耳球虫（E. duculai）和卡氏艾美耳球虫（E. kapotei），拉氏艾美耳球虫为肉鸽的优势种，原鸽艾美耳球虫为信鸽的优势种[5]。4）上海17个奶牛场（2005年-2006年）的球虫感染率为40.82%（10%～63.64%），平均OPG为1919个（100～43 500个），鉴定出6种球虫，分别是牛艾美耳球虫（E.bovis）、椭圆艾美耳球虫（E. ellipsoidallis）、邱氏艾美耳球虫（E. zürnii）、怀俄艾美耳球虫（E.wyomingensis)、柱状艾美耳球虫（E. cylindrica）和亚球形艾美耳球虫（E. subspherica）[10]。上海24个奶牛场（2010年～2011年）的球虫感染率为47.12%，平均OPG为3181个，感染率和OPG均随牛月龄的增长而下降，鉴定出10种球虫，除前面提及的6种外，另检出阿拉巴马艾美耳球虫（E. alabamensis）、奥博艾美耳球虫（E. auburnensis）、巴西利亚艾美耳球虫（E. brasiliensis）和皮利他艾美耳球虫（E. pellita）[11]。全国6个省市自治区（2010年）27个奶牛场435份粪样，除北京1个场9份粪样未检出球虫外，其余5个省市自治区的26个奶牛场全部检出球虫，426份粪样的球虫检出率为50.94%，平均OPG为3158个[12]。5）青海省4县324份牦牛粪样（2010年11月～2011年1月），球虫阳性率为34.9%，平均OPG为251，1岁内犊牛的感染率和OPG均显著高于1岁以上青年牛和成年牛，鉴定出14种球虫，除前面提及的10种外，还检出加拿大艾美耳球虫（E. canadensis）、伊利诺斯艾美耳球虫（E.illinoisensis）、孟买艾美耳球虫（E. bombayansis）和布基隆艾美耳球虫（E. bukidnonensis）[13]。

表1 我国检出的畜禽球虫种类Table 1 The Coccidian species of livestock and poultry in China

（续上表）

表2 分布达15个省市自治区的41种球虫Table 2 41 species of Coccidia distributed in 15 or more provinces, municipalities and autonomous regions

表3 国内新发现的11个球虫新种Table 3 11 new species of Coccidia identi fied in China

（续上表）

2 虫种分离

球虫的纯种分离是进行球虫形态学、遗传学、分子生物学、体外培养、免疫学以及药物筛选等研究的基础与前提条件，进行球虫纯种分离的常用方法是单卵囊分离。我们采用该方法，先后分离获得了柔嫩艾美耳球虫[14]、毒害艾美耳球虫[15]、堆型艾美耳球虫[16]、变位艾美耳球虫[17]、巨型艾美耳球虫[18]等5种球虫的纯种，对该5种球虫和布氏艾美耳球虫[19]的基本生物学特征和致病性进行了测定。观察了柔嫩艾美耳球虫配子体生殖阶段的超微结构[20]，检测了柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、变位艾美耳球虫的卵囊排泄期[21]和该3种球虫的交叉免疫保护效果[22]，规范了鸡球虫的分离、培养、鉴定、保存方法[23]。随后，又对实验室保存的6种11株鸡球虫进行了单卵囊纯化，经对单卵囊分离物进行鉴定，发现保存的布氏艾美耳球虫被柔嫩艾美耳球虫污染[24]。对实验室确定为纯种的5种12株鸡球虫，进行了线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基（mtCOI）基因片段序列的克隆和同源性与系统进化分析，结果显示球虫同种不同株间的同源性为100%，异种间为86.1%～98.4%，说明mtCOI基因可成为区分鸡球虫不同种的理想靶基因[25]。王鑫等[26]（2009）、蔡兰等[27]（2011）分别用18S rDNA基因对实验室保存的3种8株、4种15株鸡艾美耳球虫进行系统进化分析，结果球虫不同种间的同源性为96.5%～98.1%和94.6%～99.4%，巨型艾美耳球虫不同株间的同源性为98.7%～99.3%和96.9%～99.8%，柔嫩艾美耳球虫不同株间的同源性为99.7%～99.9%和99.0%～99.9%，说明18S rDNA基因不仅可以区分不同种，还有可能成为区分同种不同株的理想靶基因。这些研究结果为鸡球虫的分子遗传学鉴定提供了实验基础。

3 诊断技术

球虫病的诊断以病原学检查为主，在临床上常结合临床症状和病理剖检。为使球虫病的诊断更加规范和便于操作，在全国动物检疫标准化技术委员会的指导下，我们起草了“动物球虫病诊断技术”国家标准，由国家质量监督检验检疫总局于2002年2月正式发布（GB/T 18647-2002）[28]。该标准适用于禽类和兔的球虫病（感染）的诊断，包括病原检查和病理检查两部分，详细叙述了每项检查的操作步骤和判定依据，已在动物进出口检验检疫和现场球虫病的诊断中广泛使用。随着人们对大家畜（特别是奶牛）球虫病的重视，我们在进行奶牛球虫感染情况调查的基础上，对奶牛球虫卵囊的检测方法进行了研究[29]，考察了6种卵囊漂浮液分别对4种奶牛粪便量的球虫检测效果，确定饱和盐水为奶牛球虫卵囊检测漂浮液，10 g为合适的粪便取样量，为建立奶牛球虫病诊断技术标准奠定了基础。在逐步规范奶牛球虫病病原检测方法的同时，也开展了奶牛球虫感染PCR诊断方法的研究[30]，用提取的奶牛球虫基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后条带单一而清晰，孢子化卵囊和未孢子化卵囊均能扩增出大小相同的片断，经特异性检测，作为对照样品的安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）基因组DNA均无相同的扩增条带，实验显示其最少卵囊检出量为5000 个/mL，临床样品检测显示最少检出量的OPG为2780 个，该方法还有待进一步完善。

4 药物防治

自1939年发现磺胺类药物具有抗球虫效果以来，国内外使用过的抗球虫药物品种已超过30种，包括3大类，属于离子载体类抗球虫药有莫能菌素（Monensin）、拉沙里菌素（Lasalocid）、盐霉素（Salinomycin）、那拉霉素（Narasin）、马杜霉素（Maduramicin）、赛杜霉素（Semduramycin）和海南霉素（Hainanmycin）等及相关制剂，属于化学合成类抗球虫药主要有磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline）、尼卡巴嗪（Nicarbazin）、呋喃唑酮（Furazolidone）、球痢灵（Zoalene）、氨丙啉（Amprolium）、磺胺氯吡嗪（Sulfachlorpyrazine）、氯羟吡啶（Clopidol）、磺胺间二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine）、癸氧喹酯（Decoquinate）、氯苯胍（Robenidine）、氟腺呤（Arprinocid）、常山酮（Halofuginone）、妥曲珠利（Toltrazuril）和地克珠利（Diclazuril）等及相关制剂，属于中草药类抗球虫药主要有青蒿、驱球净、五草汤、敌球灵和白头翁散等。这些抗球虫药的使用，为有效控制畜禽球虫病、促进养殖业的发展做出了重大贡献。

上海兽医研究所从事球虫病药物防治研究近40年，建立了一套完善的抗球虫药物临床试验方法，先后完成了氯苯胍、蒽环类抗生素80334、尼卡巴嗪、马杜霉素、海南霉素、地克珠利等药物的抗鸡球虫病临床试验。率先开展了国产氯苯胍防治鸡球虫病研究，进行了氯苯胍对鸡球虫病的笼饲试验与田间试验、对鸡的安全试验、新旧工艺产品的疗效对比试验等，该项研究获得1980年上海市农业科技成果二等奖[31,32]。与上海医药工业研究院合作，开展了蒽环类抗生素80334防治鸡球虫病研究，进行了防治柔嫩艾美耳球虫病笼饲试验[33]、鸡球虫混合感染试验[34]、不同地理株防治试验[35]、野外试验[36]、对鸡的安全试验[37]、在鸡体内残留动态[38]、对柔嫩艾美耳球虫作用后裂殖体超微结构观察[39]等，该项研究获得1984年中国农业科学院技术改进三等奖[40]。与上海医药工业研究院合作，开展了尼卡巴嗪防治鸡球虫病研究，进行了笼饲试验[41]、鸡体内残留量测定[42]、田间试验与安全试验[43]、对鸡球虫免疫力产生影响的观察[44]等，该项研究获得1990年国家医药管理局科技进步三等奖[45]。与美国氰胺公司合作，承担了马杜霉素进口注册的抗鸡球虫病临床验证工作，分别完成了笼饲试验[46]和田间试验[47]。自主研制开发了抗球虫病新药地克珠利，用原料药或预混剂进行了防治鸡柔嫩艾美耳球虫试验[48]、不同剂量的药效试验[49]、防治鸡球虫病现场试验[50]、防治鸡球虫不同地理株试验[51]、防治鸡球虫5个虫种的笼饲试验[52]等，原料药和0.5%预混剂于1997年4月率先获得农业部颁发的新兽药证书[（97）新兽药证字第03号、04号]，该项研究分别获得1998年农业部科技进步二等奖和1999年国家科技进步三等奖[53]。同时开发了0.5%地克珠利溶液，考察了其预防鸡球虫病的效果[54]，于1999年4月获得农业部颁发的新兽药证书[（99）新兽药证字第04号]，该项研究获得2000年中国农业科学院科学技术二等奖[55]。与江苏省常州市第二制药厂合作，开展了海南霉素防治鸡球虫病研究，进行了该药对5种鸡球虫的药效试验[56]、防治鸡球虫病舍饲试验[57]，鸡球虫广州分离株的疗效试验[58]、鸡球虫病的预防和治疗效果评价[59]等，该产品为我国第一个获得一类新兽药证书的原创性抗球虫药。此外，还进行了水溶性氨丙啉防治柔嫩艾美耳球虫笼饲试验，经连续7 d饮水给药，其抗球虫指数（anticoccidiosis index，ACI）达188，试验组饮水量与健康对照组无显明差异[60]；比较了地克珠利、常山酮、氯羟吡啶、马杜霉素、盐霉素预防柔嫩艾美耳球虫的效果，其ACI，地克珠利、常山酮、马杜霉素均在192以上，氯羟吡啶为168～180，盐霉素为165～171[61]；进行了地克珠利、拉沙里菌素、莫能菌素防治现场奶牛球虫病研究，连续用药9 d后奶牛的球虫卵囊减少率分别为78.91%、80.92%、98.82%[62]；开展了地克珠利、磺胺喹恶啉钠、磺胺氯吡嗪钠、托曲珠利、白头翁散等5种药物对肉鸽球虫病的防治试验，其相对卵囊减少率，2种磺胺药均在98%以上，白头翁散为91%～99%，托曲珠利为88%～93%，地克珠利为67.4%～79.6%[63]。近年还研制与测定了中草药制剂TF-103[64]、化学合成药纳川珠利（Nitromezuri）[65,66]与沙咪珠利（Acetamizuril）[67]的抗球虫效果，有望开发成新的抗球虫药。

5 抗药性检测

任何一种抗球虫药的长期或不合理使用，都会导致球虫耐药性的产生。定期检测现场球虫对抗球虫药物的耐受程度，将有助于制订合理的用药方案，有效控制球虫病的发生，减少因球虫病造成的经济损失。检测球虫耐药性的方法有笼饲试验法、鸡胚试验法、细胞培养试验法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、同工酶电泳测定法、PCR测定法等，其中笼饲试验法中又采用卵囊产量、病变记分、增重、最适抗球虫活性百分率、粪便记分比率、抗球虫指数等单项或多项指标进行评定[68,69]。孔繁瑶等[70]（1994）在检测我国12个省区15株柔嫩艾美耳球虫对5种抗球虫药物的敏感性时，率先采用最适抗球虫活性百分率（percent of optimum anticoccidial activity，POAA）、病变记分减少率（reduction of lesion scores，RLS）、相对卵囊产量（relative oocyst production，ROP）3项指标综合评价所测球虫株对药物的抗药程度，分为敏感（-）、轻度抗药（+）、中度抗药（++）、严重抗药（+++）4个等级。黄兵等[71]在对上海一鸡场球虫进行3种抗球虫药物的抗药性检测中，在POAA、RLS、ROP的基础上增加了抗球虫指数（ACI），采用4项指标进行抗药性评价，分为敏感（-）、轻度抗药（+）、中度抗药（++）、严重抗药（+++或++++）4个等级。随后在对上海9个区县10个鸡场的球虫进行6种药物的抗药性检测中[72]，继续采用了POAA、RLS、ROP、ACI 4项指标来评判所检测球虫的抗药性，结果达到中度及以上抗药程度的百分比为莫能霉素100%、氨丙啉90%、氯羟吡啶80%、马杜霉素50、氯苯胍10%、地克珠利为0。陈兆国等[73]从4项指标各自的特点、评价结果的一致性、其他指标、试验总体结果等4个方面，对采用POAA、RLS、ROP、ACI进行球虫抗药性判定的准确性进行了评价，认为该综合评定球虫抗药性的方法是有效的、可靠的。我们根据现场球虫抗药性的检测结果，对相关鸡场提出了合理使用抗球虫药的建议方案，在试验基地采取了预防或减少抗药性产生的措施，有效地控制了鸡球虫病的发生，提高了养鸡场的经济效益，该项目获得2003年上海市科技进步奖三等奖[74]。至今，POAA、RLS、ROP、ACI 4项指标已在检测鸡球虫抗药性中广泛应用，如检测广东[58,75,76]、陕西[77-79]、安徽[80-82]、江苏[80,83,84]、甘肃[85]、青海[86]、河北[87,88]、吉林[89,90]、广西[91]、浙江[92]等省地区相关鸡场球虫对抗球虫药物的抗药性，均采用这4项指标进行判定。

此外，还诱导获得了柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株[93]，构建了2个抗药株与敏感株的差异表达基因消减cDNA文库，发现一些可能与耐药性产生相关的基因（如柔嫩艾美耳球虫半胱氨酸蛋白酶基因）[94]，用银染mRNA差异显示技术分析了抗药株与敏感株之间的差异表达基因[96]，并比较了抗药株与敏感株的18S rDNA基因序列和二级结构差异[97]。从消减cDNA文库中克隆和表达了与抗药性相关的基因M20[97]。根据M20基因序列设计特异性引物，建立了SYBR Green real-time PCR和TaqMan Probe real-time PCR两种用于检测球虫抗药性的方法，并用SYBR Green real-time PCR法对现场分离的球虫进行抗药性检测[98]。用双向电泳技术对2个抗药株与敏感株的第二代裂殖子[99]和孢子化卵囊[100,101]进行了蛋白质差异分析，用质谱技术分别鉴定了7个（地克珠利抗药株4个、马杜霉素抗药株3个）差异明显的蛋白质斑点，对其结构和功能进行了预测。通过对2个抗药株进行基因重组获得同时具备抗地克珠利和马杜霉素的抗药株重组体[102]，对双重抗药株、单重抗药株和敏感株进行了乳酸脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氨酸的同工酶分析[103]。这些研究为深入探讨球虫的抗药性机制奠定了基础。

6 免疫预防

抗球虫药的广泛使用，对有效控制球虫病的危害，减少养殖业的经济损失发挥了重要作用。由于球虫抗药性的不断产生，导致药物效果不断下降，生产者往往不得不增加药物的使用剂量，致使药物在畜禽体内的残留超标，为动物源性食品安全带来潜在威胁。免疫预防是球虫病防治的发展方向，既可改善球虫的抗药性，又能避免药物残留。上海兽医研究所在上世纪90年初就开始了球虫病的免疫预防研究，观察了NTG处理球虫诱导雏鸡的保护性免疫[104]和腹腔注射短小棒状杆菌诱导雏鸡对球虫的免疫保护[105]，评估了双重致弱球虫疫苗（DLV虫苗）在实验室和田间的免疫保护效果[106]，报道了6批中试产品在6个省市进行的24批区域试验结果[107]，该疫苗于2000年获得国家新兽药证书[（2000）新兽药证字第37号]，为国内批准的第一个球虫疫苗，该项研究先后获得1997年上海科学技术进步奖二等奖（鸡球虫病综合免疫预防的研究）[108]、2003年上海科学技术进步奖二等奖（鸡球虫混合苗在集约化鸡场的应用）[109]、2003年中国农业科学院科学技术成果一等奖（鸡球虫三价混合疫苗（DLV苗）免疫预防研究）[110]。后来，又开展了球虫早熟株的选育工作，先后成功选育柔嫩艾美耳球虫早熟株[111]、堆型艾美耳球虫早熟株[112]、巨型艾美耳球虫早熟株[113]，其潜在期分别比母株缩短了23 h、15 h、35 h。进行了3种球虫早熟株对8种抗球虫药的敏感性试验，巨型艾美耳球虫早熟株对地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜霉素、盐霉素和拉沙里菌素均敏感，柔嫩艾美耳球虫早熟株对盐霉素轻度敏感、另7种药物敏感，堆型艾美耳球虫早熟株对盐霉素轻度敏感、对二硝托胺不敏感、另6种药物敏感[114,115]。研究了3种球虫早熟株的免疫剂量，通过免疫保护效果比较，推荐每羽鸡接种卵囊剂量分别为柔嫩艾美耳球虫早熟株600个、堆型艾美耳球虫早熟株600个、巨型艾美耳球虫早熟株200个[116-118]。此外，还完成了早熟株疫苗的悬浮液、保存条件、保存时间、配制工艺等研究，已取得的研究结果为开发球虫早熟株疫苗奠定了良好基础。

7 体外培养

球虫的体外培养是研究球虫内生发育、入侵机制、药物筛选、虫株致弱等的重要技术平台，包括鸡胚传代和细胞培养两部分。上海兽医研究所在上世纪80年代初就进行了球虫的鸡胚传代研究，曾在鸡胚中连续传柔嫩艾美耳球虫120多代，测其致病性明显减弱，但回鸡后返强明显。后又开展了鸡肾细胞繁殖球虫研究，成功在鸡肾细胞培养物中观察到柔嫩艾美耳球虫完整的内生性发育阶段，从细胞培养物中收集的卵囊经培养孢子化后感染雏鸡获得下一代卵囊[119]。为了提高鸡胚培养球虫卵囊的收获量，我们又对鸡胚的接种日龄、子孢子接种量、胰岛素和叶酸的添加量等进行了研究，结果显示，接种9日龄鸡胚、每胚接种子孢子1×104个、在子孢子混悬液中加入胰岛素1000 U/mL和叶酸0.05 mg/mL，在37℃培养箱中培养10 d，是毒害艾美耳球虫的鸡胚培养适宜体系[120]；接种10日龄鸡胚、每胚接种子孢子1×104个、在子孢子混悬液中加入胰岛素100 U/mL，在37℃培养箱中培养8～9 d，是柔嫩艾美耳球虫的鸡胚培养适宜体系[121]。首次将鸡胚成纤维传代细胞（DF-1）应用于球虫培养，建立了柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系，通过对细胞铺板量、子孢子接种剂量、培养基中胎牛血清浓度等的摸索，优化了球虫细胞培养条件，并建立了流式细胞仪检测子孢子入侵活力的方法，确定了检测球虫子孢子入侵活力的最佳时间，比较了球虫子孢子对DF-1、MDBK（牛肾细胞）、Vero（猴肾细胞）、BHK（乳仓鼠肾细胞）、MDCK（犬肾细胞）等5种细胞的入侵活力，观测了不同浓度的子孢子多抗血清对子孢子入侵DF-1细胞的抑制情况[122]。目前，球虫体外培养技术已在球虫分子生物学领域得到广泛应用。

8 分子生物学

随着分子生物学技术的飞速发展，对球虫的研究已从宏观的普通生物学深入到微观的分子生物学，上海兽医研究所对球虫的研究也从流行病学调查与防治向核酸与蛋白质扩展。开展了用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行球虫同工酶的初步研究[123]，检测了柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、孢子囊的乳酸脱氢酶（LDH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、异柠檬酸脱氢酶（IDH）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6PGD）、磷酸葡萄糖变位酶（PGM）、碱性磷酸酶（ALP）、葡萄糖磷酸异构酶（GPI）的同工酶[124]，研究了柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、变位艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫的LDH、GPI、G6PD、ALP、6PGD的同工酶[125]。利用RT-PCR方法扩增、克隆了柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子表面抗原基因（λMZ5-7）[126,127]和热激蛋白（HSP）基因[128]，并在大肠杆菌中得到表达，经检测其重组蛋白具有抗原性，为进一步研究这些基因的生物学功能奠定了基础。应用杂交瘤技术制备了抗柔嫩艾美耳球虫A08蛋白（EtA08）和棒状体蛋白（EtRP）的单克隆抗体，用单抗对EtRP在子孢子中的分布进行分子定位，观测了经单抗处理后对子孢子入侵细胞的影响，分析了EtA08基因在球虫不同发育阶段的转录情况，构建了EtA08基因的毕赤酵母表达系统[119-131]。制备了柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶（EtLDH）单克隆抗体，用单抗对EtLDH在第二代裂殖子中的分布进行了定位[132]。针对不同种鸡球虫的保护性抗原基因不同，先后构建了柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库[133]、堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库[134]、毒害艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库[135]、巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库[136]，对部分文库进行了抗原基因的筛选[137]，经扩增和序列分析，获得堆型艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子基因[138]和堆型艾美耳球虫1个新基因（GenBank登录号：EU590120）[139]。为了筛选与鸡球虫入侵和发育相关基因，构建了柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段抑制性消减文库[140]，利用抑制性消减杂交技术（SSH）和cDNA微阵列技术，大规模筛选了柔嫩艾美耳球虫子孢子和孢子化卵囊阶段虫体差异表达基因，获得了大量差异表达基因的ESTs序列（Genbank登录号：ES346882～ES346911、ES351351～ES351428和GR935578～GR935588）[141]。根据ESTs序列，利用RACE技术扩增全长基因获得了11个含完整开放阅读框的新基因，对一些重要基因功能进行了初步研究，包括EtSerpin[142]，EtAMA1[143]，EtCDPK3[144]，EtPDI[145]，EtLDH[146]，EteIF3[147]，EtCHP559[148]等。部分功能基因在原核表达系统或毕赤酵母表达系统或动物细胞中获得表达，包括新基因ZB7-C11（Genbank登录号：GU553107）[149]、EtSAG[150]、新基因ZL583（Genbank登录号：HQ877408）[151]、EteIF3d[152]、EtCDPK3[153,154]、EtRON2[155]、EtLDH[156]、EtSIR2[157]和EtSerpin[158]等，对获得的部分重组蛋白进行了免疫保护性初步研究。构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子[159]和裂殖子[160]酵母双杂交cDNA文库，利用酵母双杂交技术以EtAMA1为诱饵在构建的子孢子文库中筛选到与之相互作用的相关蛋白14个。对其中3个EST序列进行扩增，其基因全长与基因组数据库比对，确定分别为柔嫩艾美耳球虫保守假象蛋白（EtCHP559）[161]、柔嫩艾美耳球虫胱硫醚β合成酶（EtCBS）[162]、柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（EtSTK）[163]，分别构建了这3个基因的真核重组表达质粒，在DF-1细胞中获得表达。还构建了柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4（EtCDPK4）酵母双杂交诱铒质粒，经检测没有自激活活性和细胞毒性，能在酵母细胞中表达，为筛选EtCDPK4的互作蛋白奠定了基础[164]。获得这些与球虫入侵、发育相关的关键分子或基因，对进一步探讨球虫的入侵与内生性发育机制、发现新的抗球虫疫苗候选分子和药物作用靶标等具有重要意义。

10 展望

回顾我所几十年从事球虫生物学与球虫病防治研究的历程，老一辈科学家注重科研与生产的结合，以解决养殖业发展中的难点作为科研攻关重点，在鸡球虫病的药物防治和免疫预防研究领域取得了辉煌业绩；中青年一代继承老一辈的优良传统，除继续加强抗球虫新药物和球虫疫苗研究外，在球虫病的流行病学调查、球虫的纯种建立与长期保存、体外培养、抗药性检测、球虫入侵与发育相关基因的功能研究等方面也取得了长足发展。展望未来，任务艰巨，还有许多难题需要青年一代去攻坚克难。1）在球虫病药物防治研究方面，由于新药研制的周期长、投入大，应重点加强现场球虫的耐药性监测，制订合理与合规的药物使用程序，研究消除或延缓球虫耐药性产生的方法，适当研制与开发现有药物的新制剂，延长现有抗球虫药物的生命周期。2）在球虫病免疫预防研究方面，由于我国畜禽球虫种类多、分布广，应重点加强主要畜禽球虫病的多价弱毒活疫苗研究，同时积极筛选具有种、属特征和较好免疫保护效果的抗原，寻找合适的多抗原表达载体，为研制球虫基因工程疫苗奠定基础。3）在球虫的基础研究方面，由于球虫具有较强的宿主特异性、组织特异性和细胞特异性，应重点加强不同球虫的全基因组测序，寻找不同球虫侵入不同宿主和定位于不同组织与不同细胞的关键分子，为阐明球虫的入侵与发育机制提供基础。4）在球虫的体外培养研究方面，继续寻找或建立能用于体外完成整个球虫生活史的合适细胞株，为基因编辑技术有效用于球虫研究提供基础。

球虫病仍是目前和未来较长时间里严重危害我国养殖业发展的重要寄生虫病，上海兽医研究所作为我国球虫与球虫病防治研究领域的国家队，不论是基础研究还是应用研究，都应面向世界农业科技前沿，面向国家重大需求，面向现代农业建设主战场，在国家实施乡村振兴战略中，为提升农业发展质量、促进农村社会稳定、增加农民经济收入做出应有的贡献。