鸡传染性支气管炎病毒分离株CK/CH/HD/171018的生物学特性及其全基因组序列分析

李智超，王友令，徐腾飞，栗永华，车路平，刘盼娆，仇旭升，孙英杰，谭 磊，廖 瑛，宋翠萍，丁 铲，姚 刚，孟春春，王金泉

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.山东省农业科学院家禽研究所，济南 250023）

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）是临床常见疾病之一，呈世界范围流行，世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类传染病。鸡传染性支气管炎是由冠状病毒科、冠状病毒属中的传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染性呼吸道疾病[1]。IBV基因组为单股不分节段的正链RNA，基因组长约27.6 kb[2]，具有5'端帽子结构和3'端poly(A)结构，包含5'Cap-Replicase-S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N-poly(A)3'至少10个以上开放性阅读框（open reading frame，ORF）[3]，可转录出6种亚基因组mRNA（Gene1～6）[4]。IBV的5'和3'端均存在非转录区（untranslated region，UTR）[5]。病毒基因组的5'端为复制酶（Replicase）基因（Gene1）大小约为20 kb，包含了非编码区5'UTR和编码具有活性的聚合酶的ORF1a和ORF1b独特编码区[6]，分别编码440 kDa和300 kDa多肽，下游的ORF1b可通过核糖体移码作用与上游的ORF1a形成700 kDa多聚蛋白pp1ab，ORF1a和ORF1b编码了15种非结构蛋白[7]，在RNA复制、转录和病毒复制中发挥重要作用。IBV的3'端包含Gene2～6，其中基因2、3、4、6分别编码病毒的纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和磷酸化的核衣壳蛋白（N）[8]。Gene3和Gene5是多顺子结构，是分散在编码结构蛋白的ORF之间的辅助基因，Gene3含有分别编码3a、3b和3c/E的3个ORF，Gene5含有分别编码5a和5b的2个ORF[9]。3a、3b、5a及5b均为非结构蛋白，M和E蛋白是形成病毒样颗粒和病毒出芽及装配所需的膜相关蛋白[10]。N蛋白是磷酸化的核蛋白，与病毒RNA合成有关[11]。S蛋白是病毒的主要免疫原蛋白，在体内翻译后由宿主蛋白酶切割为N端的S1和C端的S2，S1亚基附着于病毒包膜，负责病毒包膜和宿主细胞膜的融合[12]，S1糖蛋白含有诱导病毒中和、血清型特异性抗体、血凝抑制抗体和交叉反应ELISA抗体的抗原表位[13]，并且在病毒组织嗜性和毒力中起重要作用。

当前我国IB呈现常发态势，尤其在IB免疫鸡群中经常爆发IBV强毒感染[14,15]，本实验室在河北邯郸某肉鸡场中分离到1株IBV，将其命名为CK/CH/HD/171018，并对其进行了毒力测定和全基因组序列扩增与分析，为日后预防和控制IBV提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 毒株、SPF鸡和SPF鸡胚IBV分离株CK/CH/HD/171018分离自河北邯郸某免疫过IB（H120株）疫苗的发病商品肉鸡群。SPF鸡和SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。

1.2 菌种、载体及主要试剂Trizol购于Thermo Fisher Scientific，pMD19-T克隆载体购自宝生物工程大连有限公司，DH5α及普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根生化科技有限公司，5'-full RACE试剂盒、3'-full RACE试剂购于北京天恩泽基因科技有限公司。

1.3 引物设计及合成根据GenBank发表的所有IBV的全基因组序列，应用DNAStar软件包中的Clustal W方法进行比对，选择保守区域，进行引物设计，引物序列及相关信息见表1，引物送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 病毒增殖与鉴定取IBV分离株CK/CH/HD/171018通过尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，去除24 h之内死亡的胚，收集36 h鸡胚的尿囊液，-80℃保存。盲传3代，进行HA检查阴性和侏儒胚阳性检查，同时取适量病毒按Trizol试剂说明书提取病毒基因组RNA，应用RT-PCR扩增S1基因并进行序列鉴定。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 SPF鸡致病性实验取3日龄SPF雏鸡20羽，随机分为2组，每组10羽，分别经滴鼻点眼接种105.0EID50IBV分离株CK/CH/HD/171018株尿囊液及PBS，0.2 mL/羽，分两个隔离器饲养，连续观察14 d，记录接种鸡的精神状况及发病症状，对发病死亡鸡进行剖检并记录气管、肺脏及肾脏等病理变化。

1.6 病毒基因组的扩增

1.6.1 病毒RNA的提取 取适量病毒按Trizol试剂说明书提取病毒基因组RNA。

1.6.2 基因组不同片段RT-PCR扩增 根据引物Tm值，扩增反应热循环参数：针对P1～P9、P11～P16对引物，95℃预变性5 min，94℃变性1 min、55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环，72℃延伸10 min；针对P10及P17～P32引物，95℃预变性5 min、94℃变性1 min、52℃退火1 min，72℃ 延伸2 min，30个循环，72℃延伸 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳或4℃保存。

1.6.3 5'和3'RACE方法扩增病毒的5'端及3'端序列 按北京天恩泽基因科技有限公司试剂盒说明书进行。PCR反应结束后，取20 μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检查PCR结果，确认后进行DNA测序。

1.7 目的基因克隆按普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书分别将扩增的目的片段回收纯化，克隆至pMD19-T载体并进行测序。

1.8 序列拼接和基因组全序列的生物信息学分析根据GenBank中参考毒株的基因序列，利用DNAStar.Lasergene.v7.1生物软件中的Cluster W方法，将CK/CH/HD/171018与参考毒株进行比较后各基因片段拼接，并对其全基因组和各个基因片段分别与IBV参考株进行同源性比较。利用MEGA7软件将CK/CH/HD/171018株的全基因组与57个国内外参考毒株的全基因组进行序列比对并构建遗传进化树。应用RDP3软件分析病毒全基因组序列中基因重组情况，运用RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan、3Seq 7种重组分析方法来确定重组事件，运用Simplot软件进一步确定重组事件及其重组断点。

2 结果

2.1 IBV分离株CK/CH/HD/171018对SPF鸡胚致病性将IBV CK/CH/HD/171018株接种10日龄的SPF鸡胚，传至第3代时可见胎儿发育障碍、胚体头背部局部出血、胚体卷曲、羊膜增厚等典型IBV病变，与其他IBV强毒株对鸡胚的致病性一致。

2.2 IBV分离株CK/CH/HD/171018毒对SPF鸡致病性动物实验结果表明3日龄的SPF鸡感染IBV分离株CK/CH/HD/171018后出现羽毛松乱、精神萎靡及腹泻症状，个别出现呼吸道症状。攻毒组鸡群在第5 d开始出现死亡，死亡一直持续到第14 d，死亡率达到100%（图1A）。病死鸡的剖检结果显示，主要病变发生在肾脏和气管，所有死亡鸡的肾脏都病变明显，表现为肾脏明显肿大，实质苍白，小管和尿道扩张，并有尿酸盐沉积，是呈现典型的“花斑肾”症状，个别病死鸡气管有出血点，其他脏器肉眼可见病变不明显（图1B）。

图1 SPF鸡感染IBV分离株CK/CH/HD/171018后死亡情况（A）与肾脏、气管病变（B）Fig.1 Survival rate of chickens (A) and gross lesions in kidney and trachea tissues from chickens experimentally infected with IBV strain CK/CH/HD/171018

2.3 IBV分离株CK/CH/HD/171018全基因组序列测定结果基因组内部分段扩增共获得23个片段，扩增目的条带大小与预期结果基本一致；应用3'和5'RACE试剂盒扩增得到了与预期大小一致的末端片段。将得到的目的片段克隆至pMD19-T载体并进行测序。

2.4 IBV分离株CK/CH/HD/171018全基因组序列测定和拼接将测序获得的各基因片段序列利用DNAStar中Megalign程序对其进行拼接和比对，获得分离株CK/CH/HD/171018的全基因组序列。结果显示，CK/CH/HD/171018基因组的结构为5'Cap-Replicase-S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N-poly(A)3'，与典型的IBV基因组组成特征相同（表2），CK/CH/HD/171018株核苷酸全长为27 688 bp。全基因组序列登录至GenBank中，其登录号为MH020185。

2.5 IBV分离株CK/CH/HD/171018遗传进化分析本研究将IBV分离株CK/CH/HD/171018与57个国内外参考毒株的S基因（图2）进行比较，绘制系统进化树。结果表明，该分离株CK/CH/HD/171018与中国株CK/CH/LJL/140734及CK/CH/LJL/140924的亲缘关系最近，属于QX型IBV。

表2 推测分离株CK/CH/HD/171018的ORFTable 2 ORF encoded in CK/CH/HD/171018 genome

2.6 IBV分离株CK/CH/HD/171018的重组分析本研究对IBV分离株CK/CH/HD/171018全基因进行重组来源分析。首先，分离株CK/CH/HD/171018全基因、各个基因片段与参考株同源性对比，结果见表3。分离株CK/CH/HD/171018全基因与QX的同源性最高，其Gene1与CK/CH/LSC/99I型的GX-YL9株及GX-YL5株同源性高达95.5%～97%，基因S、3、M、5、N与QX型同源性较高，这一结果暗示IBV分离株CK/CH/HD/171018在Gene1上可能发生重组事件。故此，我们将CK/CH/HD/171018与参考株全基因进行重组分析。应用RDP3软件分析显示IBV CK/CH/HD/171018株Gene1中检测出2个重组事件。在事件1中，7种检测方法显著性分别达到RDP（5.517×10-47）、GENECONV（1.542×10-29）、BootScan（2.826×10-30）、MaxChi（1.644×10-15）、Chimaera（4.061×10-18）、SiScan（1.669×10-14）及3Seq（2.410×10-30），重组片段位于5661～8223 bp，重组来源minor与major母代毒株分别是GX-YL9与DY07。事件2重组片段位于14 101～18 762 bp，重组来源minor与major母代毒株分别是DY07与GX-YL9，有5种检测方法检测的重组概率P值小于1×10-12。2个重组事件均可以在Simplot软件分析中得到确认（图3）。

3 讨论

本研究分离了IBV变异株CK/CH/HD/171018株，致病性实验结果显示，分离株C K/C H/HD/171018人工感染3日龄SPF鸡后，可引起严重肾脏病变、咳嗽、甩鼻及张口呼吸等临床症状，从d5开始有死亡，死亡率达到100%，表明本研究分离株属于IBV强毒株。

本研究完成了全基因组测序，序列分析发现其与参考株CK/CH/LJL/140924基因组高度同源，同源性高达98.2%～99.6%，CK/CH/LJL/140924是吉林2014年分离株。CK/CH/HD/171018与CK/CH/LJL/140734、CK/CH/LJL/140924吉林分离株等QX基因型IBV高度同源，且全基因进化树分析都处于同一进化分支，因此我们认为CK/CH/HD/171018属于IBV QX基因型。QX型毒株在现阶段已经成为最流行的优势基因型，基因重组事件可能导致QX基因型变异株的出现[16]，每年我国许多地区都会发生IBV，且QX型IBV已在我国流行多年，给养禽业造成了巨大损失，然而近年来发现分离的QX型IBV大都存在重组现象[5,16,17]，这使得我国QX型IBV的发病情况越来越复杂，也进一步加剧了该病的流行情况。

图2 IBV分离株CK/CH/HD/171018(▲标注)与参考株S基因遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of S gene of IBV strains (CK/CH/HD/171018 marked with ▲)

IBV容易通过基因突变、插入、缺失和重组等分子机制产生新的变异株[18]，其中重组可以发生在野毒株之间，也可以发生在疫苗株和野毒株之间[19]，此外还涉及基因突变、插入和缺失等多种变异机制，目前分离的QX基因型野毒株也呈现多样性进化。由于IBV很容易通过基因重组及突变发生变异，导致出现新的变异株。本研究利用RDP3软件及Simplot 软件进行同源性分析确定了所分离到的IBV分离株CK/CH/HD/171018是通过基因重组而出现的变异株，重组现象发生在Gene1处，是QX型DY07野毒株和CK/CH/LSC/99I型GX-YL9野毒株的重组，且引起鸡群产生严重的肾脏病变及高死亡率。已有研究标明，Gene1包含表达两种多蛋白pp1a和pp1ab的复制酶基因，两种多蛋白被两种病毒编码的蛋白酶切割，通常产生16种非结构蛋白（Nsp1～16），IBV缺乏Nsp1，从而编码Nsp2～16，复制酶基因涉及病毒复制和致病性[20,21]。变异株CK/CH/HD/171018的Gene1发生野毒株之间的重组可能是决定了该病毒高致病性的原因，但确切的结论还有待进一步的证实。所以在日后IBV流行病学检测中要对在Gene1发生重组的病毒进行追踪调查其流行情况、变异机制及致病特征。

表3 IBV分离株CK/CH/HD/171018基因组与参考株序列同源性(%)比较Table 3 Pairwise sequence comparison (%) of CK/CH/HD/171018 and reference IBV strains

图3 IBV分离株CK/CH/HD/171018株基因组Simplot重组分析Fig.3 Simplot analyses of the complete genomic sequence of IBV strain CK/CH/HD/171018

本研究测定了IBV分离株CK/CH/HD/171018的全部基因组序列，从分子水平上分析了病毒基因组的分子特性，丰富了IBV的生物信息数据库，为进一步从分子水平研究IBV的流行情况、变异机制及致病特征等奠定了基础。由于QX型IBV强毒株已经成为国内优势基因型，我们必须对其进行持续的流行病学监测，同时尽快评价现有IB疫苗对此类变异株的免疫效力，从而制定更有效的防控策略。