椎间盘退变血清与尿液分子标志物的研究进展

亓东铎， 徐秀君 综述， 黄宇峰 审校

(同济大学附属东方医院脊柱专科，上海 200120)

颈腰痛是患者就医最常见的原因之一。在颈腰 痛患者中，大约39%是由椎间盘内紊乱引起的[1]。对于患者而言，颈腰痛给工作和生活带来严重的负面影响[2]，同时医保负担也很沉重。据资料显示： 颈腰痛的终身盛行率高达84%，有11%～ 12%的患者因颈腰痛而落下残疾，并且颈腰痛给医疗行业带来的影响如今日益加重，治疗成本每年剧增，仅仅美国每年在颈腰痛上的医疗相关支出和患者报酬损失就超过2000亿美元[3-4]。

目前，椎间盘退变造成的椎间盘突出等疾病的治疗策略主要以减轻临床症状为主，包括保守治疗和外科手术。如果保守治疗失败,那么通常会选择通过外科手术来减轻疼痛。脊柱融合术是治疗椎间盘突出的金标准，但是其会造成临近节段的退变，许多患者需要多次手术。近年来，通过促进细胞外基质的修复与再生来防止椎间盘退变的生物治疗方法已经得到了发展，其中包括基因治疗、基于干细胞的组织工程、调控椎间盘退变的生物因素以及microRNA的治疗等方法。随着研究的不断突破，这些新的方法也许可以替代手术，用于椎间盘退变的早期干预，但是早期干预也对椎间盘退变的早期诊断提出了更高的要求。

目前，对于颈腰椎间盘突出的诊断还是根据病史、临床体检和影像学的一致性来判断，而MRI被认为是最佳的非侵袭性影像学确诊方法[2,5]。临床上，MRI通过对椎间盘信号强弱及高度的不同来进行退变分级，但不能反映椎间盘退变的病程分期[6]，而且，影像学变化是滞后于组织病理学改变的，无法在病理变化的早期做出诊断。随着椎间盘退变研究的深入，有学者发现，椎间盘退变患者血清或者尿液中细胞外基质降解产物和某些炎症介质表达升高，并且其与椎间盘退变的病理变化同步或者早于其病理改变，相对于MRI，其可能成为椎间盘退变早期诊断的更合适的潜在分子标志物。同时，血液或者尿液分子标志物的检测对腰椎间盘退变疾病的预防、预后和精确(分级、分期)诊断提供了可能。本文对椎间盘退变血清与尿液分子标志物的研究进展进行综述，并探讨分子标志物应用于临床检测的可能性。

1 细胞外基质降解产物

椎间盘主要由终板软骨、髓核、纤维环三部分构成。脊柱作为人体质量要的承重结构之一，椎间盘在维持人体力学传递与人体脊柱活动中发挥着重要作用。其中，椎间盘的细胞外基质在维持椎间盘软骨结构光滑和缓冲作用力等方面具有重要意义。椎间盘的细胞外基质主要由蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和Ⅰ型 胶原构成。蛋白聚糖是椎间盘细胞外基质中最主要的成分之一。蛋白聚糖是一个带负电的大分子。它具有强烈的亲水性，能够维持椎间盘软骨中较高的含水量；同时蛋白聚糖能与许多椎间盘相关的生长因子结合，在维持椎间盘的生长与信号传递等方面具有重要作用。Ⅱ型胶原是椎间盘细胞外基质构成中最主要的胶原，占椎间盘干重的50%～ 60%。它是一种具有强大的抗压能力的胶原，主要位于髓核和软骨终板组织中，在维持椎间盘细胞外基质的机械稳定性，传递机械力，维持椎间盘的力学稳定中发挥重要作用。Ⅰ型胶原主要位于纤维环组织，具有防止髓核组织突出、维持纤维环结构完整的重要作用。

1.1 血清及尿Ⅱ型胶原羧基末端肽(C-telopeptide of type Ⅱ collage, CTX-Ⅱ)

Ⅱ型胶原是椎间盘细胞外基质中主要的大分子物质[7]。Ⅱ型胶原是由3条相同的多肽链-α链构成的三螺旋蛋白。α链最初的形式是α链前体，由氨基末端和羧基末端的前肽、位于中间的三螺旋结构及前肽和三螺旋结构之间的端肽三部分组成[8]。在修饰的过程中，两端的前肽被酶水解，只留下三螺旋结构和端肽，成为胶原前体，胶原前体之间再通过交联结构连接形成胶原纤维网状结构。

Ⅱ型胶原在维持椎间盘的结构稳定和功能完整中发挥着重要作用[8]。椎间盘退变的主要病理表现为髓核和纤维环中的Ⅱ型胶原降解和被Ⅰ型胶原逐渐取代[9-10]。椎间盘退变过程中，Ⅱ型胶原的降解与变化是由各种金属基质蛋白酶(matrix metallo-proteinase, MMPs)，如MMP1、MMP3、MMP13等所主导的[11]。Ⅱ型胶原在金属基质蛋白酶的作用下首先被水解成为形成了一个具有794个氨基酸大小的Ⅱ型3/4片段和具有266个氨基酸大小的Ⅱ型1/4片段。接下来这两种片段的三螺旋结构解螺旋，并进一步由其他蛋白水解酶降解。Ⅱ型胶原的终产物主要包括： CTX-Ⅱ、Ⅱ型胶原新抗原表位(TIINE)和硝化的Ⅱ型胶原-1(Coll2-1NO2)。其中CTX-Ⅱ是椎间盘内Ⅱ型胶原被MMPs降解的主要产物之一，为Ⅱ型胶原1/4片段的羧基端端肽的降解产物[12]。因此随着椎间盘退变的发生，外界的血管不断侵入，血清CTX-Ⅱ等物质则可以进入血液，这为血液或者尿液分子标记诊断椎间盘退变性疾病提供了理论基础。

目前，研究发现，血清与尿CTX-Ⅱ是骨性关节炎与类风湿性关节炎的潜在分子标志物。有研究显示，血清CTX-Ⅱ在类风湿性关节炎中显著增高，并且与MMP3呈正相关，表明血清CTX-Ⅱ可以作为类风湿性关节炎严重程度和预后判断的重要指标[13-15]。有研究表明，血清或者尿CTX-Ⅱ水平与骨性关节炎表面软骨破坏程度、K-L评分和关节间隙狭窄程度呈正相关，推测CTX-Ⅱ是骨性关节炎重要的预后判断的分子标志物[16]。另有研究发现，随着骨性关节炎与类风湿性关节炎病情的控制，血清和尿CTX-Ⅱ浓度逐渐降低，推测其可以作为判断骨性关节炎[17]与类风湿性关节炎[15]治疗效果的潜在标志物。

关于椎间盘退变中血清与尿液CTX-Ⅱ水平同样已有研究。Garnero等[18]检测了324名绝经后妇女的尿液，发现尿液CTX-Ⅱ水平与脊柱的椎间隙狭窄及伴有临床症状的膝关节骨性关节炎、手骨性关节炎均密切相关。近年来，Brayda-bruno等[19]比较了79例椎间盘正常与椎间盘退变的男性患者的血清维生素D、CTX-Ⅰ和CTX-Ⅱ水平，发现血清活性维生素D和血清CTX-Ⅱ水平在1年内呈显著的节律分布，血清活性维生素D与血清CTX-Ⅰ呈正相关，血清CTX-Ⅰ与CTX-Ⅱ水平呈负相关；且伴有骨软骨病的椎间盘退变患者血清CTX-Ⅱ水平比正常人显著升高。Meulenbelt等[20]通过分析302名患者的尿液CTX-Ⅱ水平，发现尿液CTX-Ⅱ水平与膝关节、髋关节骨性关节炎和椎间盘退变密切相关。

以上研究表明，血液和尿液的CTX-Ⅱ水平是椎间盘退变潜在的分子标志物。在椎间盘退变过程中，细胞外基质降解是其重要的病理变化之一。Ⅱ型 胶原是椎间盘细胞外基质构成最主要的胶原之一。CTX-Ⅱ具有紧密交联的肽端结构区域，其在血液中存在较为稳定,当退变发生时其降解产物释放入血，因此，血液中CTX-Ⅱ含量与椎间盘退变和细胞外基质破坏密切相关；且CTX-Ⅱ由于相对分子质量较小,容易经肾脏滤过,使其在尿液中亦较为稳定。因此，通过检测患者的血液或者尿液中CTX-Ⅱ水平，可以为椎间盘退变的预防、严重程度判断和疾病预后预测带来帮助。

1.2 血清COMP与椎间盘退变

寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)是近年来新发现的血小板钙黏附蛋白家族的重要成员，具有5个独立的次级单位，是由二硫键相连的五聚蛋白，相对分子质量为524000。1992年，瑞典LUND大学Dick Heinegard教授首先在软骨组织中发现并报道了COMP。COMP能与Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、纤维肌丝蛋白和蛋白聚糖结合，在软骨细胞外基质的构成、稳定及传递亲水分子中发挥重要作用。COMP最开始于关节软骨中被发现，随着研究的深入，研究发现其在肌腱，韧带、关节滑膜中也有不同程度的表达。

近年来，研究发现，COMP与关节软骨破环、细胞外基质降解密切相关。随着研究的深入，部分学者认为其不仅可以因为与软骨破坏及基质降解相关而有望成为膝关节、髋关节与类风湿性关节炎的骨性标志物，还可以作为膝关节与髋关节骨性关节炎预后判断与治疗效果判断的重要的分子标志物。在椎间盘的细胞外基质中，COMP通常与Ⅱ型胶原和蛋白聚糖相结合，在软骨组织胶原网中起稳定的作用，并有助于椎间盘的完整性[21]。就其本质来说，与CTX-Ⅱ类似，COMP是一类在软骨基质破坏、降解过程中释放到血液中的大分子物质。

Goode等[22]通过分析547名患者的血清COMP、透明质酸、尿液CTX-Ⅱ水平，发现血清透明质酸与女性椎间隙狭窄密切相关；同时尿液CTX-Ⅱ与椎间隙狭窄相关，血清COMP与由椎间隙狭窄患者引起的腰背痛密切相关。

椎间盘退变与骨性关节炎和类风湿性关节炎类似，是一种以细胞外基质降解为主要特点的软骨退变性疾病[23]。因此，CTX-Ⅱ与COMP作为细胞外基质降解后释放到血液的分子，是椎间盘退变潜在的分子生物标志物。目前CTX-Ⅱ与COMP在骨性关节炎和类风湿性关节炎研究较深入[24]，CTX-Ⅱ与COMP相关性及作为椎间盘退变分子标志物研究较少。其作为椎间盘退变的临床标志物的可靠性需要进一步的动物与临床实验加以研究与证实。

2 血清炎症介质

炎症分子在椎间盘的退变过程中发挥着很大作用。在椎间盘退变过程中，伴随着白介素、TNF-a、MMPs等炎症因子的产生。在椎间盘退变患者血清中，某些炎症因子表达显著升高。

Xie等[25]利用蛋白芯片技术分析了30例正常人与30例椎间盘突出患者的血清，发现载脂蛋白L1(apolipoprotein L1, Apo L1)和两种血清白蛋白前体在伴有坐骨神经痛的椎间盘突出患者中高表达，载脂蛋白M(apolipoprotein M, Apo M)、四联凝素(tetranectin, TN)和免疫球蛋白轻链(immunoglobu-lin light chain, IGL)在伴有坐骨神经痛的椎间盘突出患者中低表达；进一步通过ELISA检测，发现其中4个指标(Apo L1、Apo M、TN、IGL)差异具有统计学意义，认为Apo L1、Apo M、TN、IGL可作为椎间盘退变诊断的分子标志物。Apo L1是特异表达在正常主动脉和大血管内皮细胞中的蛋白，它的表达量常常反映TNF水平和人体炎症状态。Apo M和Apo L1是与炎症相关的蛋白[26-27]。载脂蛋白L(Apo L)是一种属于脂质运载蛋白家族的血浆蛋白质。在动脉硬化过程中，内皮细胞在长期慢性炎症的刺激下，分泌大量TNF-α，从而上调Apo L1的表达。TNF-a在腰椎间盘退变引起的炎症反应中起重要作用。TN是骨骼、肌肉细胞外基质中的重要成分，常在外伤、心肌梗死、恶性肿瘤、类风湿性关节炎时表达降低[28]。

2016年，Ye等[29]通过比较40例患者血清IL-8水平，发现椎间盘退变患者IL-8比正常人高，其表达量与椎间盘退变的分级呈正相关；并且发现IL-8能上调MMP3的表达，下调Collagen2和Aggrecan的表达。Weber等[30]通过检测107例患者血清，发现IL-6、MMP-1在伴有椎间盘退变的慢性腰背痛患者血清中表达增高，且MMP-1在慢性腰背痛患者中升高较为明显。血清IL-6水平与椎间盘退变的关系在Deng等[31]的研究中进一步得到证实。2010年，Kraychete等[32]通过比较23个正常人与10个椎间盘退变患者的血清，发现IL-1和TNF-a在椎间盘退变患者中表达显著增高。IL-1和TNF-a是在椎间盘退变中起主要作用的炎症介质，同时，研究发现血清TNF-a受体与椎间盘退变密切相关[33]。

趋化因子5(CCL5)、趋化因子6(CXCL6)是椎间盘退变过程中重要的炎症介质。近年来，Grad等[34]比较了40个正常人与40个椎间盘退变患者的血清，发现CCL5在退变椎间盘患者血清中表达量是正常人1.5倍，CXCL6是正常人1.3倍。

椎间盘退变过程中伴随着大量炎症因子的产生，炎症因子的产生同时又可以进一步加剧椎间盘退变的进程。有研究发现，炎症因子的量与椎间盘退变程度呈一定正相关。以上研究表明，椎间盘退变患者血液中的炎症介质的量或许是评价椎间盘退变程度的潜在分子标志物。

对血液与尿液分子标志物的检测虽然是一种可靠的方法，但是椎间盘退变性疾病和骨性关节炎等软骨退变性疾病类似，本质上也属于细胞外基质降解和炎症反应的软骨退变性疾病。因此上述分子标志物对椎间盘退变的疾病的诊断或许特异性不高，这需要后续研究对骨性关炎等与椎间盘在解剖与生理上加以验证与区分。随着对椎间盘解剖与生理的研究不断深入，或许椎间盘组织更加特异性的物质将被发现，这将为椎间盘的血液与尿液诊断提供新的可能。

3 展 望

目前，MRI是临床上诊断椎间盘退变的金标准，但其具有滞后于病理改变的特点——当MRI检测出退变时，患者椎间盘的破坏往往已不可逆。因此，对椎间盘退变的早期诊断可以为椎间盘退变筛查、预防及干细胞等生物治疗提供重要基础。确定血清COMP及血清和尿CTX-Ⅱ等分子标志物是否为椎间盘突出生物标志物，将为椎间盘退变性疾病的诊断和治疗提供很好的理论依据和实用基础，还可以为椎间盘退变性疾病患者提供早期筛查工具。若后续研究证明血清COMP及血清、尿CTX-Ⅱ等分子标志物不是椎间盘退变早期相关的生物学指标，相关成果也可以为后续研究提供指导。随着基因芯片表达谱的研究的深入，部分microRNA[35]、LncRNA、Runx2 mRNA[36]被认为与椎间盘退变密切相关，在血液或者尿液中检测其表达情况，发现差异表达的相关分子将是研究椎间盘退变潜在的分子标志物又一重要方向。