DNA甲基化在结直肠癌早期诊断中的研究进展

江慧洪 综述， 林谋斌 审校

(同济大学附属杨浦医院普外科，同济大学医学院胃肠外科和转化医学研究所，上海 200090)

结直肠癌是全球第三大恶性肿瘤，每年新发病例140余万，死亡近70万人[1]。现代肿瘤学认为，肿瘤是经典遗传学和表观遗传学改变累积的复杂过程，且表观遗传学改变可能更早发生[2]。DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要方式，可以在不改变DNA序列的情况下调控基因的表达[3]。近年来的研究表明，众多基因的异常甲基化在结直肠癌的早期阶段及癌前病变中就已发生，并可在患者的外周血、粪便等体液中检测到[4-6]。结直肠癌的转归及预后与病变的分期密切相关，开展早期筛查是改善肠癌患者预后的关键[7]。因此，DNA甲基化标志物有望成为结直肠癌早期诊断的有效手段，应用前景广阔。现就DNA甲基化在结直肠癌早期诊断中的研究进展作一综述。

1 DNA甲基化在结直肠癌中的作用机制

DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，CpG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶[3]。CpG序列在人类基因组中的分布很不均一，常聚集出现，称之为CpG岛。CpG岛多位于基因的启动子和第一外显子区，与56%的人类基因组编码基因密切相关[2,8]。甲基化可通过多种方式影响基因的转录和表达，包括干扰转录因子对DNA元件的识别和结合，募集组蛋白去乙酰化酶形成转录抑制复合物及改变染色质结构等。DNA甲基化异常主要表现为基因组整体甲基化水平降低和部分启动子区异常高甲基化，前者可导致原癌基因活化、基因印记缺少和染色体不稳定增加，后者则会引起抑癌基因、细胞周期调节基因和细胞凋亡基因等表达沉默[8-10]。近年来，高通量检测技术为甲基化研究提供了有力工具。目前已在结直肠癌中发现众多异常的DNA甲基化，并与肠癌的发生、发展及预后密切相关[11]。研究[12]报道，p14、HLTF、ITGA4、CDKN2A/p16、CDH1和ESR1等基因甲基化改变参与了结直肠腺瘤的形成；而TIMP3、CXCL12、ID4和IRF8等基因甲基化异常在肠癌的侵袭及转移中发挥了重要作用。此外，研究发现DYPD、TYMP、UMPK和SPARC基因甲基化状态与5-氟尿嘧啶化疗方案的疗效有关[13-14]，UGT1A1基因 高甲基化则会影响肠癌细胞对伊立替康的敏感性[15]。

1999年，Toyota等[16]首次发现在约20%的结直肠癌中存在高甲基化聚集现象，称之为CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype, CIMP)。Weisenberger等[17]提出可通过检测CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3和SOCS1基因的甲基化状态来判定CIMP。众多研究发现，CIMP阳性结直肠癌具有独特的分子病理特征，其多发生在高龄、女性患者和右半结肠，表现出较差的淋巴结转移状况和预后，并与MLH1高甲基化、BRAF突变、微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)等密切相关[18-19]。目前普遍认为结直肠癌的发生主要涉及3条分子通路： 染色体不稳定性(chromosome instability, CIN)、MSI和CIMP。在此基础上，Simons等[20]将肠癌分为CIN-only、MSI、CIMP-only、CIMP+CIN和三阴型等5种亚型，这对于结直肠癌个体化诊疗方案的实施具有重要意义。

2 血液DNA甲基化检测在结直肠癌早期诊断中的应用

肠镜检查仍是当前结直肠癌筛查最准确的方法，但成本较高，且存在一定并发症风险，患者依从性欠佳。粪便隐血检查虽然价格便宜、操作简单，但敏感性和特异性都不高。DNA甲基化异常是结直肠癌发生的早期事件，且可在外周血、粪便等体液中检测到[4]。因此，利用甲基化标志物来实现肠癌的无创早期筛查是近些年来研究的热点。

在众多血液DNA甲基化检测的研究中，Septin9最引人注目。作为与细胞分裂和细胞周期调控相关的Sept基因家族成员，其表达与结直肠癌的发病紧密相关[21]。最新的关于外周血Septin9甲基化检测诊断结直肠癌的综述显示，其总体敏感性为66%(95%CI： 64%～69%)，特异性为91%(95%CI： 90%～91%)，筛查效能明显优于粪便隐血检查[22]。研究显示Septin9检测的敏感性与肿瘤分期密切相关，在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期结直肠癌中，敏感性分别为35%、46%和63%，而在进展期腺瘤的筛查中，敏感性仅为11%，这是因为病变越早，体内循环肿瘤DNA水平越低[23]。NEUROG1属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)家族成员，在神经分化、发育过程中起着重要作用。Herbst等[24]研究显示，血液NEUROG1甲基化标志物用于检测结直肠癌的敏感性和特异性分别为61%和91%，在Ⅰ期肠癌筛查中，敏感性仍可维持在52%左右。ALX4是一种转录调控因子，研究显示它可以通过调控LEF-1的间质特异活性参与结直肠癌的起病，并在上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)中发挥重要作用[25]。Ebert等[26]发现，血清ALX4高甲基化筛查肠癌的敏感性和特异性分别为83%和70%，而当ALX4和Septin9联合检测时，虽然敏感性下降到71%，但特异性高达95%[27]。TMEFF2是一类进化保守的跨膜蛋白，在结直肠癌中呈高甲基化状态。He等[28]发现，联合分析血液中ALX4、SEPT9和TMEFF2基因的甲基化状态，诊断肠癌的敏感性和特异性分别高达81%和90%。Lee等[29]报道了4个基因甲基化组合(APC、MGMT、RASSF2A和WIF1)，其筛查肠癌的敏感性为87%，特异性为92%。这些研究均提示，多基因联合检测有助于提高结直肠癌筛查的准确性。此外，APC、hMLH1、NGFR、SFRP2、P16、HPP1和RUNX3等基因的异常甲基化也被报道是结直肠癌筛查潜在的外周血标志物[30]。

血液DNA甲基化检测存在的最大缺陷在于缺乏组织特异性，目前报道的这些标志物在结直肠癌以外的肿瘤中也存在。因此，血液DNA甲基化异常，往往还需结合肠镜检查等以确定肿瘤的位置。随着全基因组甲基化测序等新技术的应用，期望将来能发现结直肠癌特异性的标志物。

3 粪便DNA甲基化检测在结直肠癌早期诊断中的应用

与血液相比，以粪便为基础的检查存在一定优势[31]： 由于结直肠腺瘤和早期癌都发生在肠道内并与粪便直接接触，脱落的肿瘤细胞会直接混在粪便中，不仅组织特异性强，收集的肿瘤DNA量也明显更高；此外，粪便DNA检测不受饮食等因素影响，样本的采集和保存也更为方便。

目前，在结直肠癌患者粪便中可检测出的粪便DNA分子标志物有多种，可分为单基因检测和多基因联合检测两大类。2004年，Müller等[32]报道了首个粪便甲基化标志物——SFRP2，其通过调节Wnt信号通路参与肠癌的发生发展，研究显示SFRP2在肠癌筛查中的敏感性为77%～90%，特异性为77%，在腺瘤患者中检出率约为50%。Melotte等[33]发现，NDRG4是候选肿瘤抑制基因，NDRG4启动子甲基化可作为标志物用于粪便样品检测直肠癌，敏感性和特异性分别为61%和93%。Vimentin甲基化是另一个被广泛报道的粪便标志物，其诊断结直肠癌的敏感性和特异性分别为46%和90%[34]。此外，TFPI2、MGMT、RASSF2、OSMR、SPG20、SLIT2、3OST2、ESR1和PHACTR3等甲基化标志物也被报道可用在粪便样品筛查结直肠癌及进展期腺瘤[30]。Lu等[35]在粪便中联合检测SFRP2、GATA4/5、NDRG4和vimentin等基因的甲基化状态，发现联合检测的敏感性高达96.4%，明显高于各单项检测标志物。2012年，Ahlquist等[36]利用QuARTS技术研发了一种多靶点检测试剂盒，包括Vimentin、NDRG4、BMP3、TFPI2等4种基因的异常甲基化，其对结直肠癌和进展期腺瘤的筛查敏感性分别达到了90%和89%，特异性分别为85%和54%，筛查效能要明显优于血液Septin 9甲基化标志物[37]。目前，市场上已经有应用粪便DNA检测作为结直肠癌早期筛查的试剂盒，如美国的Cologuard、ColoSureTM和PreGen-Plus，国内则有“常卫清”“长安心”等试剂盒。多种指南也表明粪便DNA检测可以作为拒绝做肠镜检查人群的替代筛查方法，但检测结果阳性的受试者仍需要肠镜检查的进一步确认[38-39]。

既往甲基化研究的技术主要是基于一代测序的亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR, BSP)、甲基化特异性PCR(methylation specific-PCR, MSP)、MethyLight和甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(methylation-sensitive high-resolution melting, MS-HRM)，但存在引物设计难度大、检测失败风险高、不能获得序列的碱基状态等缺陷[40]。随着二代、三代测序技术的出现，高通量和高准确性得以实现，并带来了更多的DNA甲基化检测方法，但粪便DNA甲基化检测还需从改进粪便处理流程，筛选更佳的标志物组合等多方面进行优化。

4 展 望

表观遗传学改变是结直肠癌发病机制中的驱动事件，而且DNA甲基化对肠癌基因组的影响比基因突变更大、更早。目前的研究表明，基于血液、粪便样品中的甲基化标志物的检测有望为结直肠癌无创筛查提供一种经济、高效的手段。但如何优化DNA甲基化标志物的检测流程，提高筛查的敏感性和特异性，是提升结直肠癌无创筛查技术性能所需克服的又一难题。相信随着研究的深入和各种高通量研究手段的应用，DNA甲基化检测定将成为结直肠癌早期诊断的有力工具。