鸡球虫抗药性检测方法研究进展

毕菲菲,韩贞艳,郝振凯,于咏兰,索 勋,刘贤勇

(中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

1 鸡球虫及鸡球虫病

艾美耳属(Eimeria)球虫隶属顶复门、真球虫目、艾美耳科[1]，广泛寄生于鸡、兔、鸭和鹅等动物的肠道或肝脏、肾脏等部位[2]。寄生于鸡肠道内的艾美耳球虫有7个种，分别是柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、堆型艾美耳球虫 (E.acervulina)、毒害艾美耳球虫 (E.necartrix)、巨型艾美耳球虫 (E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)和早熟艾美耳球虫(E.precox)[3]。鸡球虫病对养禽业危害极大。据报道,全世界每年用于抗球虫药的费用及因球虫病暴发造成的经济损失达24亿美元[4]。

2 球虫抗药性

自20世纪40年代以来，多种药物被尝试用于防治鸡球虫病。而自1945年开始，美国学者就从田间分离到了对磺胺类药物具有抗药性的虫株[5-6]；到了20世纪60年代，则相继发现针对不同药物的不同抗药株[7]。孔繁瑶等[8]1994年首次报道我国12个地区都普遍存在柔嫩艾美耳球虫抗药株之后，全国各地相继报道出现抗药虫株。迄今为止，几乎所有的抗球虫药均有抗药虫株出现，且抗药虫株表现出对与该药同类或作用机理相同的其他药物一定程度的交叉抗药性[9]。

寄生虫抗药性一般被认为是药物控制寄生虫的失败，但抗药性的广义定义是对药物敏感性的转变[10]。针对所有生物而言，抗药性是“在使其他细胞毁灭或抑制的药物作用环境下，一个细胞及其后代仍然能暂时或长期生存或繁殖的能力”[11]。球虫学家Chapman博士则认为抗药性是对存在于球虫群体中突变体定向选择的结果[12]，这为我们进行抗药性机制研究提供了很好的思路。

3 抗药性的检测方法

3.1 鸡体试验法 目前检测鸡球虫抗药性常用的方法是鸡体试验法，此方法是将供试药物按一定浓度饲喂鸡只，经一定时间后接种鸡球虫孢子化卵囊，然后通过不同的抗药性检测指标单独或联合来判定球虫的抗药性，常用的评价指标有如下几个。

3.1.1 相对卵囊产量(Relative oocyst production, ROP) 按照药品说明书配置药物并用于相应的组别。投药48 h后，每只鸡经口接种1×104～1×105个孢子化卵囊并收集感染后96～168 h的粪便。使用改良麦克马斯特计数板计算样品中的总卵囊量。计算公式：ROP=(感染给药组平均卵囊产量÷感染不给药组)×100%。

3.1.2 病变记分减少率(Reduction of lesion scores, RLS) 球虫感染后第6天或第7天扑杀试验鸡，按Johnson[13]等所述方法进行病变记分。计算公式：RLS =(感染不用药对照组平均病变记分-感染用药组平均病变记分)/感染不用药对照组平均病变记分×100%。

Mcdougald L[14]等以感染用药组与感染不用药组的病变记分计算出用药组病变记分减少率，用其判定球虫对药物的抗药性或敏感性。Jeffers[15]以感染用药组的平均盲肠病变记分大于或等于感染不用药对照组的50%作为对莫能霉素抗药性的标准，检测了美国73个鸡场柔嫩艾美耳球虫分离株对1×10-4g/kg莫能霉素的敏感性，结果证明均无抗药性。

3.1.3 最适抗球虫活性(Optimum anticoccidial activity, POAA) 评价抗球虫药物效果最有用的标准是感染急性期的体重增加。从接种当天到第5天或第6天或在最大生长抑制期间测量体重的增加。计算公式：最适抗球虫活性POAA=(感染用药组增重-感染不用药组增重/不感染不用药组增重-感染不用药组增重)×100%。

Mcdougald L[14]等比较了接种后第6天试验期内感染用药和感染不用药对照组的增重，结果显示，感染用药组与不感染不用药对照组、感染不用药对照组增重的差异较显著。

3.1.4 综合判定 以POAA≤50%判为+，>50%为-；RLS<50%判为+，RLS≥50%为-；ROP≥15%判为+，ROP<15%为-。

判断标准为 ---为敏感，--+为轻度抗药，-++为中度抗药，+++为严重抗药。

用上述指标，刘颖[16]等初步确定了柳州市区域性鸡球虫的抗药性；姚惠娟[17]等发现野外混合球虫对地克株利、马杜拉霉素、氯羟吡啶、盐霉素4种抗球虫药完全抗药；谢婷[18]等发现河池市分离的鸡球虫对磺胺喹噁啉钠中度抗药，对地克珠利和盐酸氯苯胍完全抗药。

3.2 同工酶分析测定法 同工酶分析法是根据敏感虫株与抗药虫株同工酶谱的不同，先确定某种药物的抗药虫株特异性同工酶谱，再将田间分离的虫株进行同工酶分析，比较分离株和抗药株的酶谱， 根据二者差异是否显著而判断是否产生了抗药性[19]。国外学者利用葡萄糖磷酸变位酶(PGM )作为遗传标记分析了巨型艾美耳球虫中苯甲氧喹啉抗药性因子的转移情况[20]。

3.3 超微结构比较法 具有抗药性的虫株，其超微结构会发生相应的变化，以避开药物作用的位点。比如，莫能菌素在离体条件可显著影响球虫敏感虫株的超微结构，致其裂殖子膨胀、细胞浆空泡化、细胞膜结构模糊、破损和细胞整体形态发生改变[21-22]。

3.4 RAPD测定法 随机扩增多态性DNA (Random amplified polymorphic DNA, RAPD)是一种以PCR为基础的基因分析方法。该方法用单一或多个随机核苷酸序列作为引物，对基因组DNA进行扩增，避免了PCR特异性引物设计上的困难，尤其在对未知样本的鉴定方面，显示了其独特的特点[23]。

4 展望

目前鸡球虫的抗药性检测方法仍无统一标准，用来检测球虫抗药性的方法各存在优缺点。随着各位学者研究的不断深入，在常用方法的基础上，发展出了更多的检测鸡球虫抗药性的方法，现代分子生物学技术，如RAPD 技术、RT-PCR法是较为精准的检测方法，具有广阔的应用前景。

随着生物化学，细胞生物学以及分子生物学等技术的发展，同时对球虫生物学特性、代谢机制和耐药机制的解析，有目的地开发高效、低毒、广谱的抗球虫新药，以及提取中草药有效成分，研制安全、有效的基因工程苗和核酸疫苗，更好地了解艾美耳球虫的动物流行病学，药物的作用方式和对它们的抗性机制以及免疫机制，将有助于改进控制鸡球虫病的方法。